目的：利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP，在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法：以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应（PCR）的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列，利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷（dATP）反应，在EGFP序列两3’端加“ ，将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5ct，经蓝白筛选，挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定，正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP用XhoI和BamH1分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b，低熔点琼脂糖回收EGFP eDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连，转化感受态大肠杆菌DH5ct并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序，获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基p-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）进行N一树脂柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结杲：经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP eDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP eDNA序列完全一致，从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BI21（DE ）并经诱导后得到高效表达，表达量可达66me，/100ml菌液，SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论：表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。