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论文编号 201806-41
论文题目 重组L-门冬酰胺酶表达纯化及理化性质表征
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重组L-门冬酰胺酶表达纯化及理化性质表征

首发时间:2018-06-07

徐珊珊 1   

徐珊珊(1992-),女,硕士研究生,主要研究方向:蛋白质纯化与功能研究

郑伟娟 1    2   

郑伟娟(19),女,教授、硕导,主要研究方向:蛋白质纯化、分离与性能研究

华子春 1    2    3   

华子春(1964-),男,教授、博导,主要研究方向:蛋白质结构与功能关系

  • 1、南京大学生命科学学院,南京 210023
  • 2、江苏省产业技术研究院医药生物技术研究所/常州南京大学高新技术研究院,常州213164
  • 3、南京大学深圳研究院,深圳518057

摘要:目的:重组表达和纯化L-门冬酰胺酶,对其与白蛋白结合能力等性质进行检测,为重组L-asp的进一步结构与功能关系研究和蛋白质工程改造奠定基础;方法:采用改良脉冲稀释法纯化L-门冬酰胺酶,对纯化所得蛋白采用奈氏试剂法测其酶活,动态光散射检测重组L-门冬酰胺酶粒径分布,微量热泳动检测蛋白与人源白蛋白的结合能力,CCK-8在细胞水平检测重组蛋白对淋巴癌细胞以及对正常细胞的的杀伤作用,最后对重组L-门冬酰胺酶体外血浆半衰期进行检测。结果:纯化所得蛋白纯度为90.14%,产率为5.23 mg/L,酶的比活性为201.21 IU/mg;重组蛋白的平均粒径为6.25±0.16 nm;细胞水平活性显示:48 h后,L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为4.15 IU/mL和4.65 IU/mL;72 h后,L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为2.40 IU/mL和2.01 IU/mL;重组L-asp蛋白与HSA的亲和力为14.15 μmol/L,体外血浆半衰期为25 h。结论:本文建立了重组L-asp的表达纯化方法,对重组L-asp的性质进行了表征,为重组L-asp的进一步结构与功能关系研究和蛋白质工程改造奠定了基础。

关键词: 生物工程 门冬酰胺酶 白蛋白结合 细胞毒作用 体外血浆半衰期

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Expression and Purification of Recombinant L-Asparaginase and its physical and chemical properties study

XU Shanshan 1   

徐珊珊(1992-),女,硕士研究生,主要研究方向:蛋白质纯化与功能研究

ZHENG Weijuan 1    2   

郑伟娟(19),女,教授、硕导,主要研究方向:蛋白质纯化、分离与性能研究

HUA Zichun 1    2    3   

华子春(1964-),男,教授、博导,主要研究方向:蛋白质结构与功能关系

  • 1、School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210023
  • 2、 Reserach Institute of Pharmaceutical Biotechnology, Jiangsu Industrial Technology Research Institute and High-Tech Research Institute of Nanjing University at Changzhou, Changzhou 213164
  • 3、Nanjing University Shenzhen Institute, ShenZhen 518057

Abstract:Objective: To express and purify recombinant L-asparaginase (L-asp) and detect its binding ability to albumin to provide a basis for understand the structure-function relationship and protein engineering of L-asp protein. Methodology: The modified pulsed dilution method was used to purify L-asp. The enzymatic activity of the purified protein was measured by the method of Nissler\'s reagent, dynamic light scattering was used to detect the particle size distribution of the recombinant L-asp, and microscale thermophoresis was used to detect the binding ability between L-asp protein and human serum albumin protein. CCK-8 assay was measured on lymphatic cancer cell and normal cell for the cyto-toxicity effect. The plasma half-life of recombinant L-asp was also detected in vitro. RESULTS: The purity of the purified protein purified by the pulse dilution method was above 90.14%, the yield was 5.23 mg/L, and the specific enzyme activity was 201.21 IU/mg. The average size of the recombinant protein was 6.25±0.16 nm. The cellular assay displayed that after treated by L-asp for 48 h, the IC50 against Jurkat or Raji cells was 4.15 IU/mL or 4.65 IU/mL respectively, and after treated for 72 h, the IC50 against Jurkat or Raji cells was 2.40 IU/mL and 2.01 IU/mL, respectively.The affinity of recombinant L-asp protein to HSA is 14.15μmol/L. The plasma half-life in vitro is 25 h. Conclusion: The current research established a expression and purification method of recombinant L-asp and characterized the property of recombinant L-asp. It lays a foundation for the further study of structure-function relationship of L-asp and modification by protein engineering.

Keywords: Biotechnology asparaginase albumin binding cytotoxicity plasma half-life in vitro

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徐珊珊,郑伟娟,华子春. 重组L-门冬酰胺酶表达纯化及理化性质表征[EB/OL]. 北京:中国科技论文在线 [2018-06-07]. http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201806-41.

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