复合敲除mrdA和mrcB提高大肠杆菌胞外重组蛋白生产水平研究

王拂祥; 杨海泉; 卢潇; 王浩坤; 沈微; 刘龙; 陈献忠

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复合敲除mrdA和mrcB提高大肠杆菌胞外重组蛋白生产水平研究

首发时间：2019-01-04

王拂祥 ¹
王拂祥(1994-),男,主要研究方向:微生物工程
杨海泉 ¹
杨海泉(1985-),男,副教授/硕导,主要研究方向:酶工程与技术/微生物工程
卢潇 ¹ 王浩坤 ¹ 沈微 ¹ 刘龙 ¹ 陈献忠 ¹

1、江南大学生物工程学院，无锡 214122

摘要：在这项工作中，参与细胞壁生物合成的两个关键基因（mrdA和mrcB）在大肠杆菌中被敲除，并且研究这两个基因敲除后对细胞胞外重组蛋白分泌的影响。mrdA和mrcB基因分别编码青霉素结合蛋白PBP2和PBP1B。与对照细胞相比，转肽酶基因敲除菌株的生长没有受到显著抑制，但通过流式细胞仪和透射电子显微镜发现细胞形态发生了改变。在转肽酶基因敲除菌株中，细胞胞内可溶性肽聚糖的浓度增加，尤其是复合敲除菌株。与对照相比，转肽酶基因敲除菌株的细胞外蛋白质分泌水平显著提高，其提高的顺序是双敲除>mrcB的单敲除>mrdA的单敲除。与对照细胞相比，复合敲除菌株BL21-△mrdA/△mrcB-pET28a-gfp产生的细胞外绿色荧光蛋白含量有显著增强（2.6倍）。与对照细胞相比，转肽酶基因敲除菌株中重组成纤维细胞生长因子受体2和胶原E4的细胞外分泌水平也有相应的提高。复合敲除菌株BL21-△mrdA/△mrcB-pET28a-amyk的胞外淀粉酶活性相对于对照细胞增加了5.2倍，但在BL21-△mrdA-pET28a-amyk和BL21-△mrcB-pET28a-amyk中的胞外淀粉酶活性相对于出发菌株分别增加了1.7倍和4.3倍。转肽酶基因敲除菌株的胞外α-半乳糖苷酶活性也有提高，尤其是复合敲除菌株（2.6倍）。与对照细胞相比，转肽酶基因敲除菌株的膜通透性（内膜和外膜）得到提高，这可能增加重组蛋白的胞外分泌。

关键词：大肠杆菌 PBPs蛋白基因敲除蛋白胞外生产细胞形态

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Improving extracellular recombinant protein production in Escherichia coli by double deletion of mrdA and mrcB

WANG Fuxiang ¹
王拂祥(1994-),男,主要研究方向:微生物工程
YANG Haiquan ¹
杨海泉(1985-),男,副教授/硕导,主要研究方向:酶工程与技术/微生物工程
LU Xiao ¹ WANG Haokun ¹ SHEN Wei ¹ LIU Long ¹ CHEN Xianzhong ¹

1、School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122

Abstract：In this paper, two key genes (mrdA and mrcB) involved in cell wall biosynthesis were deleted (singly and doubly) in Escherichia coli, and the effects on extracellular recombinant protein production were investigated. The mrdA and mrcB genes encode penicillin-binding protein (PBP) 2 and PBP1B, respectively. The growth of deletion mutants was not significantly inhibited compared with control cells, but cell morphology was altered, as demonstrated by fluorescence-activated cell sorting analysis and verified by transmission electron microscopy. The concentration of intracellular soluble peptidoglycan was increased in deletion mutants, especially the double deletion mutant. Extracellular protein production was significantly improved in deletion mutants compared with controls, in the order double deletion > single deletion of mrcB > single deletion of mrdA. Extracellular green fluorescent protein production by the double deletion mutant BL21-△mrdA/△mrcB-pET28a-gfp was most significantly enhanced compared with control cells (2.6-fold). Extracellular production of recombinant fibroblast growth factor receptor 2 and collagen E4 was also improved in deletion mutants compared with control cells. Extracellular amylase activity of the double deletion mutant BL21-△mrdA/△mrcB-pET28a-amyk was increased 5.2-fold relative to control cells, but activity in BL21-△mrdA-pET28a-amyk and BL21-△mrcB-pET28a-amyk single deletion mutants was only increased 1.7- and 4.3-fold, respectively. Extracellular α-galactosidase activity of deletion mutants was also improved, especially the double deletion mutant (2.6-fold). Membrane permeability (inner and outer membrane) of deletion mutants was improved compared with control cells, which might increase extracellular recombinant protein production.

Keywords： Escherichia coli, PBPs, double deletion, extracellular protein production, cell morphology

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王拂祥，杨海泉，卢潇，等. 复合敲除mrdA和mrcB提高大肠杆菌胞外重组蛋白生产水平研究[EB/OL]. 北京：中国科技论文在线 [2019-01-04]. http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201901-36.

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论文题目	复合敲除mrdA和mrcB提高大肠杆菌胞外重组蛋白生产水平研究
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