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山东大学齐鲁医院神经外科刘玉光教授访谈

2017年12月07日 作者:中国科技论文在线 浏览量:12347

  近日,中国科技论文在线专访了山东大学齐鲁医院神经外科刘玉光教授,刘教授就合格的科研人员需要具备哪些基本素质、研究生应如何走上学术之路等问题发表了观点,并介绍了近期正在从事的研究工作及其现实意义。下面是具体的访谈内容。

一、合格的科研人员需要具备哪些基本素质?

  一名合格的科研人员需要具备哪些基本素质?这是人们经常提及的一个问题。我作为一名临床科研人员,根据中国的国情,结合体会谈一下自己的观点。

  (一)事实求实   这是科研人员最基本的素质,因为科研是对一些现象或问题经过科学方法来获得客观事实的过程。所以,追求事实、发现事实、解释事实是科研的目的。偏离的这一点,任何“伟大的发现”都不值得一提。综观科研历史,由于受到名利、体制等各种因素的影响,真正能做到一生科研中没有一丝“添加水分”的科研人员微乎其微。但是,尊重事实这一基本点不能改变。另外,勇于接受质询也是一名合格的科研人员需要具备基本素质之一,因为科研质询具有分别科研成果真伪之功能。

  (二)科研能力  即发现问题、解决问题的能力。这是一名合格的科研人员必须具备的一种能力。这种能力可以在具有科研潜质的条件下通过培养获得。具有较强的科研意识与科研思维也是科研能力的体现。科研意识即创新意识,就是对科研活动的有意识的追求和探索,它是由科研的信念与热情、科研的知识与经验以及科研的眼光与智慧三个要素来涵盖。科研思维就是用科学的思维方式来解决有待于解决的问题,这需要长期的锻炼,养成科学思维的习惯。敏感的信息的获取能力也是一种科研能力。一个优秀的科研人员,必须有一个优秀的获取文献和信息的能力。当今社会中,外语能力、计算机网络能力等有助于提高获取文献和信息的能力。

  (三)把握能力  一名合格的科研人员应该时刻知道自己在做什么?能做什么?为什么这样做?这样做的意义?做出的成果怎么样才能转化应用?换一句话说,就是要把握科研项目的可行性与价值。要想成功地进行科学研究,必须把握科研活动的可行性;而一项优秀的科研成果体现在它的理论价值或实用价值上。因此,一名合格的科研人员应具有把握自我、把握课题的能力。所有不切实际、没有实际意义的科研活动都是不可取的。另外,较强的政策把握能力与正确的政治立场也是一名合格的科研人员应当具备的,否则,将一事无成。

  (四)科研态度   就是对科研的信念与热情,说高尚一些就是敬业精神,通俗一点说就是要对科研感兴趣。自觉地追求真理的精神是取得卓越的科研成效的必要条件之一。中国不缺乏潜在的科研精神,但是,不好的科研制度压抑了这种潜在精神转化为现实的努力。试想,我国从申请科研项目到科学实验、从发表学术论文到评审科技成果、从专业技术资格晋升到荣誉称号的授予,无处不存在行政权利的运作,让真正想从事科研的研究者感到沮丧和无助。因此,当今中国,为科研事业奋斗者少,为科研职业谋生者多。中国的科研体制决定了在中国真正合格的科研人员并不多。

  (五)合作能力  一项优秀的科研成果仅靠一个人是难以实现的。无论是国外还是国内科研工作,都在讲科研团队,团队意味着合作。小到人与人间的合作,大到国际间的科研机构合作都离不开科研人员的个人合作意愿。因此,不具有合作能力的人肯定不适合搞科研。从历史上诺贝尔奖金获得者来看,大多数获奖者是与他人合作完成的。

  (六)专业能力与设疑能力  创新的前提是继承。没有扎实的专业知识能力,仅靠满腔的热情是搞不成科研的。专业知识是一个合格的科研人员进行发现问题、正确思考问题与解决问题的前提条件。同时,也应做到不唯书、不唯上,不迷信权威。另外,只有具备扎实的专业知识才能具有一定的设疑能力,设疑能力是创新的源泉。正确的设疑能力可以使人对司空见惯、习以为常的问题产生疑问,从而发现问题,解决问题,有所创新。

  (七)科研道德   科研道德的好坏决定一个科研人员科研道路的长短。一名合格的科研人员应当坚持真理,恪守实事,自觉抵制科研不端行为,正确行使学术权利等。

 

二、研究生应如何走上学术之路?

  一名研究生在具备的上述科研人员基本素质后,还应当树立正确的学术态度、正确的学术精神与正确的学术责任才能真正走上学术之路。

  (一)正确的学术态度  克服浮躁心态,培养科研兴趣,端正学术态度,自觉遵守学术规范,坚决抵制学术不端行为。

  (二)正确的学术精神   就是客观公正,实事求是,严密求证,兼容并蓄。学术应当具有独立性,不应当依附于政治,即学术自由。坚持求真务实、崇尚创新。

  (三)正确的学术责任  学术责任是学者在开展学术活动、处理学术事务和学术关系时应做的事情、应尽的职责。在强调学术自由的同时也应勇于承担学术责任。学术责任包括学者对学术本身的忠诚、遵守学术道德以及学术研究所承担的社会责任等。捍卫学术自由也是科研人员必须承担的学术责任。

三、请您介绍一下近期正在从事的研究工作及其现实意义。


《TTC复合嗜神经载体系统的构建及其在神经移植应用中的研究》
国家自然科学基金项目
山东大学齐鲁医院神经外科 刘玉光

内容提要

  构建一种高效特异靶向性的嗜神经载体是当前神经移植领域急需解决的问题。破伤风毒素片段C(TTC)能够特异性地与某些神经细胞上的神经节苷脂结合而被摄取,且无毒性。目前神经干细胞(NSC)移植中缺乏高效特异载体。本研究通过对大鼠各时期NSC胞膜表达神经节苷脂进行研究,分别用不同方法构建几种特异高效的TTC复合嗜神经载体系统,利用绿色荧光蛋白做示踪剂,比较哪种更理想并确定合适的转导条件。再把NSC向神经元分化过程的重要因素Shh信号作为目的基因通过构建的载体导入NSC,并对NSC进行抗炎、抗氧化预处理,然后通过几种途径进行大鼠中枢损伤模型实验研究,并与肌肉注射法比较,观察Shh表达及诱导神经元分化作用,进而探究所构建的嗜神经载体是否高效特异安全地转导NSC并且表达目的基因,及改造后的NSC靶向趋向于运动中枢的能力,并对其相关特性进行定性和定量研究。

 

一、研究的主要内容及现实意义

  随着老龄社会的到来,中枢神经系统疾病越来越成为严重地危害着人类,脑卒中和帕金森病等脑部疾病使众多中老年人丧失自理能力;而颅脑损伤已成为现代社会青少年致死的主要病因。中枢神经系统因其发育、解剖、功能的复杂性和其细胞的脆弱性导致许多中枢系统疾病都非常棘手,基因治疗和神经细胞移植在颅脑疾病治疗方面显示前所未有的作用。然而,要成功进行神经细胞移植和基因治疗,必须首先把基因高效而安全地导入特定的神经细胞或组织中去,且能够使转基因细胞靶向性趋向于中枢的特定部位,这样才会有良好效果且尽量降低副作用,所以建立一种理想的载体系统迫在眉睫。

  理想的载体应具备以下特点:生物安全性好;细胞靶向性高;细胞转染效率高;外源基因可持续表达;工业生产可行。传统的基因载体系统分为病毒载体介导系统和非病毒载体介导系统。病毒载体基因转导效率较高,但存在一些问题,如病毒的毒力复燃性、致瘤性及基因转导的靶向性等,限制了其应用。非病毒载体少有危险性,但生物分布和胞内运转尚不是十分明确,基因转染率不理想等问题。一些病毒载体如反转录病毒载体只能转染分裂活动期细胞,而大部分NSC处于静止状态。因此,寻找一种神经细胞特异性载体一直是人们梦寐以求的。综合两类载体各自优点而克服互相缺点的载体将会比较理想;同时,若能在特异转导基因的基础上,使受体细胞拥有了体内靶向性,则是更胜一筹。

  基因治疗在脑内移植中的方法主要包括离体途径和直接途径,前者指先在体外利用基因工程修饰细胞后再将其输注体内,后者指载体携带的基因、RNA或蛋白直接导入体内。转基因NSC为神经再生和中枢神经系统解剖及功能重建提供了巨大贡献。但是,NSC移植尚存在许多问题,例如NSC增殖、分化、迁移的细胞内外环境调节控制机制尚不十分清楚。因此,使神经干细胞朝着预想方向分化的任何手段都是目前研究的热点。这种定向分化取决于种子(NSC自身调控机制)、营养(营养物质及能源供应)、土壤(微环境及细胞因子)。而这些要素的首要条件就是怎样更好地改造“种子”及观察种子的变化,即寻找一种特异高效的神经干细胞基因工程载体,把目的基因特异、高效而安全地导入并利用之在构建模型中研究,目前此方面相关研究甚少;而通过此种载体改造后若能使NSC不用经颅途径却能靶向趋向于中枢神经系统特定区域,又将解决NSC如何定向移植同时不损伤颅脑的棘手问题。利用重组病毒载体把DNA带入人体内,或裸DNA直接注射,或受体介导,或人工材料介导,已有不少研究。但是针对体内介导中枢神经细胞的特异载体系统还在探索中,有许多问题有待解决,如DNA体内注射后的降解,中枢靶向性,病毒载体危险性等问题。寻找一种安全、靶向性强、体内稳定性较好的载体,同样有着深远的意义。

  破伤风杆菌是厌氧梭状芽胞杆菌中的一种,感染后存活于动物伤口内无氧或微氧环境。它分泌的破伤风毒素是一种强烈的嗜神经毒素,能够特异性结合于神经肌接头的神经元胞膜并介导内吞作用,阻碍乙酰胆碱的释放,导致感染者机体强直性痉挛、抽搐至死亡;它还可逆向轴突运输至神经元胞体,并可在相邻神经元突触区跨神经元传输。该毒素结构与功能的关系已经阐明,其在神经细胞上的结合位点是神经节苷脂,而进一步研究证实破伤风毒素的异源二聚体能比其他任何已知蛋白更有效的进入中枢神经系统。破伤风毒素的轻链亚单位可导致神经功能障碍,而重链亚单位只负责介导吸收及运输,是无毒的,其具体功能区是破伤风毒素片段C(Tetanus Toxin C, TTC)。TTC有高度的神经元亲和性,在介导吸收方面具有类似于全毒素功能。

  研究表明TTC片段有着巨大潜力,可用作开发神经相关细胞基因转导的载体或直接投递外源性生物分子(如DNA或蛋白)至神经中枢。

  多项研究表明TTC复合物对神经细胞转导是无毒的而且是有效的,这为TTC在中枢神经系统疾病中的应用奠定了基础。已有人通过基因融合法或化学连接法把TTC和示踪剂连接起来,这又为TTC融合体系的可行性奠定了基础。研究发现携带有绿色荧光蛋白(GFP)-TTC基因的质粒在被转染进神经细胞后,其表达的融合蛋白在没有信号肽辅助的情况下也可以独立被分泌到细胞膜外,并可以被邻近细胞再摄取,他们发现这是因为GFP-TTC融合蛋白表达后经过一定时间窗,先聚集于内质网,再经高尔基体分泌出胞,这为其作为载体跨细胞传递而进一步提高转导效率铺平道路。这种TTC复合物同时可以作为标记物,较之细胞质标记物优势在于它有细胞膜标记物作用,而且实验证实其对死细胞膜片段很少贴敷,所以能够起到鉴别受体细胞的活性的作用,在活细胞示踪等方面也有很大帮助。最近,已有人构建了ABCD系统(A基因层,B脂膜层,C多聚分子层,D生物识别层),它是分别由THC、BHC和脂质体、PEG组建的转基因复合载体,用其转导Hela细胞、N18-RE105细胞和SH神经母细胞瘤细胞,探索了这种复合体在神经相关细胞转导方面应用的价值,但未在神经干细胞方面探索,且没有活细胞标记物引导下的体内实验的报道。

  随着研究的进展,相继发现原来感染外周运动神经元的破伤风毒素,可以提取其无毒的重链Hc段使之与神经元、脑膜细胞、以及胶质瘤细胞特异结合,所以有学者提出利用TTC片段作为载体治疗神经肿瘤的概念,也有人利用TTC把辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶或超氧化物岐化酶靶向引导至中枢神经系统,进行了一些实验并取得成果。研究表明,许多神经疾病诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩(SMA)、帕金森病、胶质瘤、脑损伤、脊髓损伤、外周神经损伤等等,其相关问题的解决能受惠于高效特异的神经细胞特异性靶向载体系统。然而作为神经科学的一个重点-神经干细胞(NSC),却未见其与破伤风毒素Hc段(TTC)相关关系及应用基础的研究。而且人们发现NSC上存在神经节苷脂受体,可以作为潜在的TTC位点。所以我们设想构建一种特异高效转导NSC的载体系统,而且此种载体转导NSC后细胞膜表面表达出能结合运动神经元的TTC配体,进一步使NSC在体内移植后能靶向性趋向中枢运动神经元区。我们利用pcDNA3.1来达到使TTC转导NSC后能表达于细胞膜表面这个策略。

  另外,示踪标记方面我们选择EGFP。绿色荧光蛋白(GFP)是从维多利亚水母( aequorea victoria) 中分离出来的一种荧光蛋白。该蛋白性质稳定,在异源细胞中大量表达而无细胞毒性,用特定波长的蓝光激发后在荧光显微镜下可以观察到明亮的荧光,检测方法简单,灵敏性高,可用于对活细胞和蛋白质进行实时定位和观察。EGFP为GFP的加强型。理想的EGFP 融合蛋白应该是既能发出明亮的绿色荧光又不影响目的蛋白的生物学特性,由于EGFP晶体构象呈紧密的桶状,外源蛋白分子不易影响其自发荧光功能,许多实验也已经证明由于EGFP 分子量小,一般不影响所融合的目的蛋白的构象和生物学特性。所以,EGFP 和TTC基因或蛋白被融合在一起,自发绿色荧光的有无及强弱就能真实反映出TTC在转导中的表达和分布情况。目的基因方面我们选择诱导NSC向运动神经元分化的因素中较重要的Shh信号。

  针对以上所述研究意义和研究现状,我们提出以下设想:

  第一,确定各个发育时期的NSC或NPC细胞膜表面神经节苷脂的表达、分布、及亚型有无差异及变化情况,进而选出最适于TTC转导的NSC。

  第二,根据TTC的特点,综合病毒载体的高效性和非病毒载体的安全性,构建一种特异高效转染神经干细胞(NSC)的TTC载体系统并探索利用其进行基因移植的方法,并与现已有的TTC载体和基因移植方法比较,建立一种新的可用于NSC基因工程改造、研究NSC生长迁移和分化、或者对中枢系统基因移植有发展潜力作用的体系。

  第三,进一步利用这个体系探索神经移植中的应用,鉴定转导后的NSC靶向性趋向运动中枢的相关特性。

二、研究目标

  本课题旨在寻找一种嗜神经载体并寻找新的脑内移植理念,以解决目前脑内移植和转基因NSC的特异载体问题。首先系统地研究NSC胞膜ganglioside的表达情况;再根据受体配体特异性结合的原理以及TTC的嗜神经特性,利用基因重组技术构建几种TTC复合载体并筛选其最佳条件和结构形式,建立离体途径高效转染NSC的模型和体内途径中枢靶向基因移植模型;使用该模型转染的NSC进行诱导预处理后,对动物脑损伤模型进行移植并观察某些指标,结合项目主持人的前期科研成果,最终到达建立一套高效特异的脑内移植基因载体系统的目标。

三、拟解决的关键问题

  拟解决的关键问题即为检测NSC的TTC受体表达情况,创立一套基于TTC的高效特异NSC载体系统并对载体的构建优化,找准适合转染的各种条件及载体模式,并比较离体和体内两种方法下不同TTC复合体的起效作用情况,并研究TTC复合体的转染及代谢机制,为基因治疗在脑内移植中的科研及临床价值的进一步深化提供依据。