【目的】蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，简称球囊菌）是一种能够侵染中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）幼虫的致死性真菌病原。微小RNA（microRNA，miRNA）可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析，进而揭示DEmiRNA在蜜蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道（AcCK和AcT）进行测序，通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNAs的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA，其长度分布介于16 ~35 nt之间，且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA，包含31个上调和23个下调miRNA，可分别靶向结合6170 和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目，富集基因数最多的皆为结合、细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路（pathway）富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway，富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明，DEmiRNA及其靶mRNAs形成十分复杂的调控关系；31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs，18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNAs；miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后，随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证，结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息，揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御，miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。