【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂Apis cerana cerana（简称中蜂）幼虫肠道参考转录组进行de novo组装，并进行功能及代谢通路注释，进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫，将纯化的球囊菌孢子饲喂3日龄幼虫，剖取4、5和6日龄幼虫肠道，液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis（简称球囊菌）的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads，利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx（E-value＜10−5）比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库，对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索，并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物，通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads，de novo组装得到43 557个unigenes，平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库，单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示，11 442条unigenes分布于25个基因家族，其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多，达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示，在生物学进程分类中，注释到细胞进程的基因最多，达4 201个，在分子功能和细胞组分类中，注释到结合与细胞的基因数最多，分别为4 935和2900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路，注释到核糖体的基因数最多，达385个。利用MISA软件，可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点，随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增，有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】本研究成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组，可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息，也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组，基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记，可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究，也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。