【目的】微小RNA（microRNA，miRNA）是一类在转录后水平对mRNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在通过分析意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）幼虫肠道发育过程中差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）及其调控网络，提供miRNA的表达谱和差异表达信息，揭示DEmiRNA在幼虫肠道发育中的作用。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道样品（Am4、Am5和Am6）进行测序，将质控后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对，然后将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库，并利用TPM（tags per million）算法归一化处理所得miRNA的表达量，再通过相关生物信息学软件对miRNA进行表达量聚类、前体二级结构预测及差异表达分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNA的靶基因，使用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库注释，进而通过Cytoscape软件构建miRNA-mRNA的调控网络。采用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序分别得到10 841 644、14 655 839和9 230 496条有效序列标签；Am4 vs Am5比较组包含16个上调和10个下调miRNA，Am5 vs Am6比较组包含5个上调和7个下调miRNA。其中，novel-m0031-3p为两个比较组所共有，并结合5个与蜕皮激素诱导蛋白相关的靶基因;二者的特有DEmiRNA数分别为25和11个。Am4 vs Am5的26个DEmiRNA结合5 742个靶基因，其中2 725个靶基因可注释到GO数据库中的46个GO term，并主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和单组织进程等；Am5 vs Am6的12个DEmiRNA结合3 733个靶基因，且其中2 725个靶基因富集在结合、细胞进程、单组织进程和代谢进程等41个GO term；此外，两个比较组中的DEmiRNA分别有1 046和676个靶基因可注释到116和92条KEGG代谢通路，且Am4 vs Am5比较组的DEmiRNA的靶基因富集在Wnt信号通路、Hippo信号通路、嘌呤代谢和内吞作用等通路上的数量均高于Am5 vs Am6比较组。进一步分析结果显示Am4 vs Am5中的上调和下调miRNA可分别结合611和85个靶基因，其中ame-miR-6052结合的靶基因数最多，可通过结合5个靶基因,参与对细胞色素P450的调控；miR-281-x结合49个靶基因,并间接调控组氨酸代谢、TGF-β信号通路以及Hippo信号通路；Am5 vs Am6中的上调和下调miRNA可分别结合43和431个靶基因，其中miR-iab-4-x结合靶基因数量最多，并广泛参与调控背腹轴的形成、Hippo信号通路、Wnt信号通路、FoxO信号通路、Notch信号通路以及mTOR信号通路等与生长发育相关的通路。调控网络分析结果表明，DEmiRNA与靶基因间形成较为复杂的调控网络，DEmiRNA居于调控网络的中心位置，而mRNA位于调控网络的外周。最后，通过茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）对随机选取的3个DEmiRNA进行验证，结果证实了测序数据的可靠性。【结论】在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析，并对DEmiRNA的调控网络进行构建及分析，发现意蜂幼虫通过调节包括ame-miR-6052、miR-iab-4-x、miR-281-x和novel-m0031-3p在内的多个miRNA的表达水平对肠道生长和发育进行调控，研究结果不仅提供了意蜂肠道发育过程的miRNA表达谱及差异表达信息，也为阐明意蜂幼虫肠道的发育机理打下了基础。