Glutathione (GSH) is a critical antioxidant for protecting the airway epithelium from oxidant injury and its levels are mainly controlled by glutamate-cysteine ligase (GCL), which is the rate-limiting enzyme in GSH synthesis. A full understanding of the gene regulation mechanism of this important enzyme may disclose the role it plays in respiratory diseases. GCL is made up of two differentially regulated subunits, a catalytic or heavy subunit (GCLC) and a modifier or light subunit (GCLM). Many studies in this field led to the findings of important positive regulatory regions of the GCLC promoter. For a detailed analysis of this gene regulation in the respiratory system, we cloned a l.76-kb 5'- flanking region of the rat GCLC gene, inserted into a luciferase reporter vector. Exonuclease III was used to cut the 5'-flanking region of the rat GCLC gene unidirectionally into deletion mutants of different lengths. Sequential deletion analysis revealed that regions from -403 to - 111 and from -705 to - 613 are involved in positive regulation and the region from -745 to - 705 is involved in negative regulation of the GCL gene in rat lung epithelial L2 cells. Specific proteins binding to these regions were confirmed by electrophoretic mobility-shift assays (EMSAs) and antibody supershift assays. An E-box motif was found in the negative regulatory region -745 to -705. Site-directed mutagenesis proved that the functional element in this negative regulatory region was a putative E-box element. EMSA and supershift assays showed that USFI and USF2 can specifically bind to the E-box element. Overexpression of USFs in L2 cells led to a decreased activity of the GCLC promoter. Westem blotting demonstrated that the expression of GCLC protein was decreased in the retroviral USFs-expressing cells than in nontransfected (no DNA added) cells, suggesting that USF binding to the E-box at - 729/- 724 serves to trans-repress GCLC gene expression. These findings indicate that the E-box is an important transcriptional suppressor element in the GCLC promoter in rat lung epithelial L2 cells. Inhibition of interaction between the E-box and the USF may provide an effective means of ameliorating oxidant injury of the lung.

目的探讨红霉素对过氧化氢（HzOz）诱导的支气管上皮细胞表达炎症介质白细胞介素.8（IL-8）及抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的影响和可能的作用机制。方法培养16-HBE株的人支气管上皮细胞，应用四甲基偶氮唑蓝（MrIT）法观察过氧化氢及红霉素对细胞生长的影响。将传代后的细胞按24、36、48 h3个时间段分组，每个组再分为对照组、Hz oz组、红霉素+Hzoz组。通过酶联免疫吸附实验检测细胞上清中IL-8的浓度；通过凝胶迁移率阻滞实验（EMSA）来检测转录因子核因子KB（NF-KB）和激活蛋白-1（AP-I）的活性；通过酶联免疫检测仪检测细胞内GSH、谷氨酰半胱氨酸合成酶（y-GCS）的含量；应用Western印迹检测谷氨酰半胱氨酸合成酶重链亚单位（y-GCS-HS）蛋白表达。结果红霉素（5yg/ml）预孵育36、48h后可以抑制H202 （0.01rrirriol/L）诱导的HBE上清中IL-8的含量；红霉素（5 yg/ml）预孵育36、48 h后可以下调HzOz（0.01mmol/L）诱导的支气管上皮细胞转录因子NF-kB、AP-I的活性；红霉素（5LLg/ml）预孵育48 h抑制H202（0.01 mmol/L）访导的HBE细胞GSH和y-GCS的含量（3.46t0.41）以及y-GCS-HS蛋白表达、y-GCS-HS启动子区域AP-I转录活性。结论红霉素通过下调NF-KB、AP-I的活性而抑制H202诱导的炎症介质IL-8的释放，进而影响GSH及y-GCS的合成调控。

目的分析大鼠1谷氨酰半胱氨酸合成酶（y-GCS）催化亚单位（GCLC）基因5 7端调控区域和相应转录因子的特性。方法克隆1 760 bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc（GCLC/pGL-3），利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的5’端序列单向切成不同长度的缺失体，将所构建的GCLC-Luc及其11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞，通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域，并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子，最后通过电泳迁移率改变实验（EMSA）以明确该调控区的顺式元件和转录因子。结果实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的1 1个缺失体。将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性：GCLC-Luc（-1758/+2-Luc），缺失体1（-1231/+2-Luc），缺失体2（-1108/ +2-Luc），缺失体3（-1087/+2-Luc），缺失体4（- 876/+2-Luc），缺失体5（-745/ +2-Luc），缺失体6（- 705/ +2-Luc），蛱失体8（-613/ +2-Luc），缺失体9（-595/+2-Luc），缺失体10（-403/ +2-Luc）和缺失体11（- III/+ 2-Luc）的荧光素酶值分别为（90012t2445）、（77652±840）、（149927t4 915）、（71 588±1108）、（99283t2612）、（75 443±1438）、（282772t046）、（96 89lt2 275）、（148 917±5 966）、（258 991±5 015）和（895±49）U。EMSA证实核因子l（NF-1）、CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）能与- 705-613 bp区段的序列结合，活化蛋白1（AP-I）、核因子KB（NF-KB）能与-403一-111 bp区段的序列结合，上游刺激因子（USF）能与-745-705bp区段的序列结合。结论GCLC基因的-403--111 bp和- 705--613 bp区段属正调控区域，NF-I、C/EBP、AP-1、NF-KB等转录因子能与这些正调控区域结合并可能参与GCLC基因的表达调控；-745-705bp属负调控区域，USF能与该负调控区域的E-box元件结合，提示E-box写USF相互作用可能抑制GCLC基因的表达。

目的：探讨尾加压素11(urotermin 11，U一11)对兔肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的作用及机理。方法： 采用植块法培养家兔PASMCs，以MTI"测定和[ H]一胸腺嘧啶核苷([H]一TaR)掺入法观察u一Ⅱ对PASMCs增殖的 影响，加入不同浓度的几种细胞内信号转导阻断剂，观察对U一Ⅱ效应的影响。结果：U一Ⅱ(10-mol/L-10。 moL/L)浓度依赖地促进PASMCs的A值增加及[ H]一TdR掺入，以10-moVL U-Ⅱ的作用最明显，A值和[H]一 TdR掺入量分别较对照组高42.9%和68.5%(P<0.05)。101。mol/L U一Ⅱ对PASMCs增殖无作用。尼卡地平、W7、 I-I7、PD,m在一定浓度范围内(10～mol/L一10I5ol/L)均可以浓度依赖地抑制U一Ⅱ诱导的PASMCs的A值增加及 [sH]一TdR掺入增加。在浓度为10I5 mol/L时，其抑制作用最明显，A值的抑制率分别为42.3% 、19.6% 、23.2% 和10.5%(P<0.05)，[H]一TdR掺入量的抑制率分别为46.6%、9.8%、21.7%和14.7%(P<0.05)。结论：U一Ⅱ具有较强的促PASMCs增殖的作用，其诱导PASMCs增殖是通过 、CaM、PKC、MAPK来介导的。

目的探讨血管内皮生长因子（VECF）与烟雾暴露所致大鼠肺气肿发病的关系。方法36只12周龄雌性SD大鼠随机均分为烟雾暴露组（S组）和正常对照组（N组）。S组随机均分为S.、S2、S，组，分别烟雾暴露2、4、8周；N组亦随机均分为N.、N2、N3组，在常氧下再饲养0、4、8周。分别用逆转录.聚合酶链反应（RT-PCR）和改良的链霉亲合素.生物素一过氧化物酶复合物（SABC）法检测大鼠肺内VEGF mRNA、VEGF及其受体2（KDR，激酶插入区包含受体）蛋白表达水平；苏木精一伊红（HE）染色评估S组大鼠肺部病理改变，用平均内衬间隔（MLI）与平均肺泡数（MAN）评估肺气肿程度。用SPSS 10.0进行方差分析、非参数检验和相关性分析。结果 （1）S组大鼠出现肺部炎症，至第8周（即S，组）出现早期肺气肿样改变，S，组的MAN较同时段N，组显著下降，MLI显著增加（P<0.05）；（2）S组大鼠肺组织VEGF表达及肺血管内皮细胞KDR表达显著下降：S.组与N.组比较，VECF189 mRNA及肺泡、支气管上皮VECF蛋白表达下降（P<0.01）；S2组与N2组比较，VECF189、VEGF165，VEGF121 mRNA及肺泡、支气管上皮VEGF蛋白表达均显著降低（P<0.01）；S：组VEGFmRNA表达与N3组比较差异无显著性（P>0.05），但肺泡、支气管上皮细胞VECF蛋白质表达及肺血管内皮细胞KDR表达水平显著低于N3组（P<O.01.P<O.01，P<0.05）；（3）肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞VECF蛋白表达下降与MAN减少呈显著正相关（r=0.43., =0.37；P均<0.05），与MLI增加呈显著负相关（r=-0.42，r=-0.37；P均<0.05）。结论烟雾暴露能抑制大鼠肺内VEGF及其受体KDR表达，VECF在烟雾暴露所致的大鼠肺气肿发病过程中可能具有重要意义。

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（ bFCF）在低氧性肺动脉高压发病中的可能作用。方法：应用逆转最多聚酶联反应（RT - PCR}技术观察低氧犬鼠肺动脉bFCF的表达水平，并理察bFCF对高体大鼠肺动脉环收缩功能的影响。结果：①低氧时，肺动脉bFCF mRNA表达明显增加，bFCF与B- actin的RT - PCR反应产物的放射强度（coums- min -1）之比由对照的0. 5074上升到0.9182（低氧1周）和0.7812（低氧2周）（P均<0.05）.②hFCF能收缩离体大鼠呻血管环，收缩强度与剂量相关（r =0.695.P<0.05），其ECso为2.62×10 -7mol/L，结论：提示bFCF可能参与低氧性肺动脉高压的发病过程。

通过发现内皮素对肺动脉及肺平滑肌细胞功能缺氧性肺动■■■■■■■■■■■■■■■缺氧性肺动脉高压发病中的作用。取大鼠肺动脉制成3 mm长的血管环，让血管环在最佳静惠张力下平衡一段时间后，按累积法向浴槽内加入内皮素1，用二道生理记录仪记录不同浓度的内皮素1对血管环收缩功能影响。另采取单层贴壁培养末兔肺动脉中膜平骨肌细胞，在低血清培齐条件下，加入不同班度的内皮素1，分别用氚标胸朦嘧啶和氚标亮氨酸掺八率来评估内皮素1对肺动脉平滑肌细胞DNA和蛋白质争成的捉进作用：结果发现：①内皮素1能引起肺动脉剂量傲赖性收缩（r=0.935，P<0.00），在（1-12）io-gmovL浓度范围内，内皮素1所引起的血管张力迅速上升，由40±6 rng上升至347±12mg.当难度高于12×10-9fllOI/L时，收缩张力上升速度减慢。②当内皮素1浓度为l x lO-1×lO-a moVL时、肺动脉平滑肌细咆氚标胸朦嘧啶脱氧核苷和氚标亮氨政掺凡率呈现剂量依赖性增加（r分别为0.756和0.840，P<0.05）。其ECjo分别为10.87moUL和8.54 mol/L。结果提示，内皮素具有较强酌肺血管活性。

缺氧性肺动脉高压的确切发病机理目前仍不甚清楚。本文以原位杂交技术观察了癌基因erbB在缺氧大鼠肺内的表达情况，结果发现缺氧7天后，大鼠肺组织内erbB mRNA表达明显增加（P<O.OOl）.并一直持续至缺氧21天后，提示erbB癌基因可能与缺氧引起的肺血管结构的改建过程有关.

本文原位杂交技术动态观察了慢性低氧大鼠肺内原癌基因Jun、fos和myb的表达，结果发现：（1）正常大鼠肺内有一定量的jun mRNA表达，少见到myb及fos的表达：（2）低氧1同时.Jun的表达较正常下降.2周后有听增加.低氧3周后.jun的mRNA表达较正常明显上升：（3）低氧1、2周后，myb的表达明星增加.3周时基本恢复到正常水平：（4） fos原癌基因在低氧1、2周时有一定量的表达.低A3用时遮最大值.提示低氧可刺鞋大鼠肺内雁癌基因Jun、myb和fos的表达.

以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测了慢性缺氧大鼠肺组织内内皮素-I（ET-1）mRNA。内皮素受体-A（ETR-A）mRNA和一氧化氮合成酶（NOS）mRNA的表达水平。结果显示：缺氧1.2、3周时，肺内ET-1 mRNA分别较正常对照上升63.8%、105.5%和40.g%（P均<0.05）。ETR -A mRNA分别上升50.6%。57.4%和56.3%（P均<0.05），而NOS mNRA则分别较正常对照下降34.2%、49.6%和33.5%（P均<0.05）-提示缺氧时肺内ET水平上升和NO减少与缺氧刺激肺内ET-1 mRNA表达增加和NOS mRNA表达减少有关。