为了进一步研究乙型肝炎病毒（HBV）的s基因变异在免疫逃逸中的作用，我们通过酶消化质粒载体pEcob（含双拷贝HBVDNA），得到约900bp的HBV-s基因片断。将其插入到噬菌载体pBluescriptSK+的 Smal位点上。然后通过体外寡棱苷酸介导的人工定点突变获得一系列（共种）s基 因“免疫逃逸”突变型。再通过 EB病毒真棱表达载体pMEP4将s基因突变型片断定向克隆pMEP4上，从而构建了含HBVs基因突变型的重组质粒pMEP4HBSM。用其转染人肝癌传代细系HepG2，经潮霉素选择，3周后获得抗性细胞克隆经用HBV-s单克隆抗体检测发现除含变异145（gp145位上甘氨酸为精氨酸替代）外，其余变异体HBsAg均为阳性。经 Western blot杂交证实异体145在分子量约为24000处也存有一特异性HBsAg蛋白带。这一表达细胞系的成功建立HBV免疫逃逸的诊断和治疗提供了基础。

通过基因重组方法构建含HBVS基因的噬菌粒载体pBluescnpt ks+HBVS。利用此重组载体，制备了HBVS基因的单链DNA模板。经体外寡核苷酸介导的人工定点突变技术。突变HBV的“a”抗原头定族基因，从而获得一系列共12种S基因的“a”头定簇基因变异型克隆。分别将其亚克隆至真核表达载体pMEp4上，转染人肝癌细胞系HepG2，经筛选获表达HBV“a”抗原头定簇基因变异抗原的表达细胞克隆。

目的研究与乙型肝炎病毒感染的临床进程相关的两种乙型肝炎表面抗原（HBsAg）插入变异体的免疫学性状，以阐明在HBsAg阴性的慢性乙型肝炎病毒感染中所起的作用。方法利用体外PCR诱变方法.构建重组HBsAg的插人突变体；借助EB病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1将重组插入变异S基因转染哺乳动物细胞；利用EHSA及Western blot方法，探讨变异抗原与抗HBs的结合力。结果（1）构建了HBsAg的插A突变体（分别在 HBsAg的第122位与123位氨基酸间插入Arg, Ala和第123位与124位氨基酸问插入Arg，Glv，Ala）的真核表达载体；（2）将其转染哺乳动物细胞，最终建立了能表达野生型和变异型 HBsAg的HepG2细胞系；（3）这些细胞系能在体外稳定地连续传代培养；（4）野生型HBsAg可与抗HBs结合，变异型HBsAg不能与抗HBsAg结合。结论研究表明这两种插人变异体影响了HBsAg的空间结构.从而使其失去与乙型肝炎病毒表面抗体的结合力，因而可能逃避机体的免疫清除而持续存在于体内形成慢性感染。

构建HBx基因真核表达载体，导入HepG2细胞中，无血清培养同步化后，Western杂交检测HepG2-X细胞IGF-IR，PCNA和VEGF表达增强，但无p21CIPI/WAFI表达，流式细胞检测细胞周期，HepG-Xo细胞70%进入Go-Gi期，而HepG2-X细胞仅56%进入G0-G1期，与血清培养亲本HepG2细胞几乎相同.HBx基因增强IGF-IR表达，通过信号通路到细胞核，同时使PCNA表达增强，p21CIPl/WAFl表达抑制，推进细胞周期，使G0-G1细胞明显减少.HBx基因增强VEGF表达，通过旁分泌作用使血管内皮增生；以上可能是HBx蛋白致HCC的机理之一。

目的研究人单核细胞来源的树突状细胞（DC）激活的HBsAg特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对表达HBsAg的HepG2/S靶细胞的杀伤的效应，以探索DC-HBsAg疫苗在抗乙型肝炎病毒（HBV）中的作用方法从健康外间血中分离出单核细胞，在粒细胞巨噬细胞集落刺激因了（GMCSF）和白细胞介素4（11.4）的作用下培养7D诱导出DC，然后以DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL，将携有HBV-S基因的Plxsn/s重组质粒电击导入肝癌细胞系（HepG2）,建立表达HBsAg的靶细胞模型HepG2/S；用染色法检测HBsAg特异性CTL寻HepG2/S靶细胞的杀伤效应。结果DC激活的HBsAg特异性CTL对HepG2/S靶细胞具有较强的杀伤效应，不同浓度HBsAg（0μg/L, 50μg/L和100μg/L）诱导的CTL的杀伤率分别为3.8%、69.5%和85.1%，而CTL对HepG2细胞无明显杀伤效应，结论由DC激活HBsAg特异性CTL具有较强的特异性抗HBV作用。

目的通过经母婴传播获得乙肝炎病毒（HBV）感染的慢性无症状乙型肝炎表面抗原携带者（ASC）母子体内HBvpreS/S基因序列研究，了解来源相同的HBV在不同程度病毒血症情况下PreS/S基因变异的特点。方法选择15对母孕前为HBV感染、未接种过乙型肝炎疫苗日均未使用过抗HBV药物的Asc母子。应用T-A克隆技术构建重组质粒PGEMPreS/S、双酶切进行鉴定，每个患肯选2个酶切鉴定正确的克隆测序并进行分析。结果选择15对ASC母子，根据HBV病毒血症高低分为3组，每组5对，A组母子均为高病毒血症，B组子女为高病毒血症、母亲为低病毒血症，c组子女为低病毒血症、母亲为高病毒血症。高病毒血症患者均为乙型肝炎e抗原（+），低病毒血症均为抗HBe（+）。母子HBV亚型相同，各组中有4/5对母子为B/adw2、1/5对母子为C/adrq+亚。对每组中B/adw2亚型HBV患者的PreS/S基因进行分析显示：高病毒血症组间或低病毒血症组间HBVPreS/S基因变异数目及位点差异均无显著性，变异与年龄无关，低病毒血症患者变异数目及位点明显高于高病毒血症患者。两个低病毒血症组PreS/S基因绝大多数变异位点相同（113个），其中变异热点85个、可引起37个氨基酸变异，这些变异的氨基酸大多位于免疫表位内或（和）其附近。结论HBV变异可能与感染的时间长短无关；在发生乙型肝炎e抗原血清转换后的低病毒血症患者体内，HBVPreS/S基因出现较多的变异，且有规律，可能与病毒逃避免疫攻击有关。