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2010年08月31日

【期刊论文】绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

王琦, 田涛, 王琦*

微生物学杂志,2005,25(1):48~73,-0001,():

摘要

荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白(Green nuorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β-半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细茵与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。

关键词: 绿色荧光蛋白, 标记, 微生物, 表达

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2009年11月03日

【期刊论文】凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

黄爱龙, 闫歌, 蒲丹, 唐霓, 张秉强, 高小玲, 宋文鑫, 何通川

重庆医科大学学报,2004,29(3):266~268,-0001,():

摘要

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达。方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和Western Blot检测Survivin蛋白的表达。结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒Pegfp-Cl-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Survivin蛋白的表达。结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达。

关键词: Survivin, 绿色荧光蛋白, 真核细胞, 表达

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2009年10月21日

【期刊论文】pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

王一飞, 董晓, 王家宁黄永章郭凌郧

郧阳医学院学报,2005,24(6):321~325,-0001,():

摘要

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“ ,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5ct,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP用XhoI和BamH1分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP eDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5ct并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基p-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)进行N一树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结杲:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP eDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP eDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BI21(DE )并经诱导后得到高效表达,表达量可达66me,/100ml菌液,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。

关键词: TA克隆载体, 增强型绿色荧光蛋白(, EGFP), 重组质粒, 蛋白表达, 蛋白纯化

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2006年11月09日

【期刊论文】Pluripotency potential of human adipose-derived stem cells marked with exogenous green fluorescent protein

田卫东, Yunfeng Lin, Lei Liu, Zhiyong Li, Ju Qiao, Ling Wu, Wei Tang, Xiaohui Zheng, Xizhe Chen, Zhengbin Yan and Weidong Tian

Molecular and Cellular Biochemistry 291: 1-10, 2006.,-0001,():

摘要

暂无

关键词: human adipose-derived stem cells, green fluorescent protein pluripotency

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2006年11月09日

【期刊论文】绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究

田卫东, 李志勇, 刘磊, 陈希哲, 林云锋, 闫征斌, 陈玲, 李声伟

华西口腔医学杂志,2005,23(2)152~154,-0001,():

摘要

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCS)体外定向诱导下的多向分化潜能。方法取6周龄GFP转基因小鼠1只,用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获得GFP转基因小鼠骨髓MSCS有限细胞系(GFP-MSCS)。取第3代GFP-MSCS进行体外多向分化诱导:成骨诱导后进行碱性磷酸酶增殖活性检测及茜素红钙盐染色;成脂肪诱导20d后进行油红O染色鉴定;成神经诱导6h后用免疫组织化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)的表达。结果GFP-MSCS经成骨诱导后ALP表达较对照组明显升高,20d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导后油红O染色阳性;经成神经诱导后,细胞形态由梭形转变为星状细胞,NSE染色呈强阳性表达。结论GFP转基因小鼠骨髓MSCS在体外诱导下具有多向分化能力,对GFP稳定表达无影响,可以作为研究MSCS多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。

关键词: 绿色荧光蛋白, 转基因小鼠, 骨髓间充质干细胞, 多向分化潜能

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2006年11月09日

【期刊论文】Expression of exogenous or endogenous green fluorescent protein in adipose tissue-derived stromal cells during chondrogenic differentiation

田卫东, Yunfeng Lin, Weidong Tian, Xizhe Chen, Zhengbin Yan, Zhiyong Li, Ju Qiao, Lei Liu, Wei Tang and Xiaohui Zheng

Molecular and Cellular Biochemistry 277: 181-190, 2005.,-0001,():

摘要

暂无

关键词: adipose tissue-derived stromal cells, chondrogenic differentiation, green fluorescent protein

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2006年07月27日

【期刊论文】以GFP为标记的肝癌细胞RNA转染树突状细胞的体外效应

任军, 张利旺, 张红梅, 刘文超, 潘伯荣, 斯晓明

第四军医大学学报,2006,27(11):1046-1048,-0001,():

摘要

目的:探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性。方法:绿色荧光蛋白质粒载体pGFP2C3稳定转染肝癌细胞HepG2,Trizol法提取筛选后细胞HepG2-GFP总RNA;分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞,总RNA转染DCs,荧光显微镜下观察转染效果,流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化; EL ISA法检测转染前后上清中IL212变化情况;MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。结果:pGFP2C3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2-GFP,荧光显微镜下呈绿色荧光;总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光,CD80(13.2%上升至86.7%),HLA2DR(38.9%上升至97.9%),CD83(0.9%上升至97.1%),CD86(31.2%上升至92.5%)表达明显升高,上清IL212分泌量ng/L显著增高(61.3±8.1→287.4±29.3,P<0.05);诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用。结论:GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记,肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗。

关键词: 树突状细胞, 绿色荧光蛋白, RNA, 转染

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2005年10月14日

【期刊论文】A novel tri-primer PCR method (TP-PCR) for rapid construction of fpg gene

陈英旭, Ying Xu Chen a, *, He Liu a, Wen Bo Zhang b, Yong Feng Jin b

Y. X. Chen et al./Journal of Microbiological Methods 56 (2004) 359-364,-0001,():

摘要

暂无

关键词: Tri-primer PCR (, TP-PCR), Fused fgp gene, Catechol 2,, 3-dioxygenase, Green fluorescent protein

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2005年06月30日

【期刊论文】Protoplast transformation and regeneration of transgenic Valencia sweet orange plants containing a Juice Quality-related Pectin methylesterase gene

郭文武, WENWU GUO, YANXIN DUAN, OSCAR OLIVARES-FUSTER, ZHENCAI WU, COVADONGA R. ARIAS, JACQUELINE K. BURNS, JUDE W. GROSSER*

Plant Cell Reports(2005) DOI: 10.1007/s00299-005-0952-x,-0001,():

摘要

暂无

关键词: Citrus,, green fluorescent protein,, juice quality improvement,, in vitro grafting

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2005年06月30日

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2005年04月29日

【期刊论文】A novel tri-primer PCR method (TP-PCR) for rapid construction of fpg gene

金勇丰, Ying Xu Chen a, *, He Liu a, Wen Bo Zhang b, Yong Feng Jin b

Journal of Microbiological Methods 56(2004)359-364,-0001,():

摘要

暂无

关键词: Tri-primer PCR (, TP-PCR), Fused fgp gene, Catechol 2,, 3-dioxygenase, Green fluorescent protein

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2005年03月04日

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2006年06月30日

【期刊论文】杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

朱江, 胡兆丽, 王文兵, 朱江*, 李新平, 沈颂东

生物工程学报,2005,21(4):530~533,-0001,():

摘要

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)的重组病毒,以该病毒日本c3株基因组DNA为PCR扩增模板,根GenBank SphMNPV中国G2株基因序列,设计了两时引物分别扩增多角体蛋白基因的5’端侧翼序列(舍启动子)和3’端侧gf/- 列(舍终止子),将这两个片段依次克隆于pUCl8质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SphMNPV基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选。获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SphMNPV-gfp,SphMNPV-gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达:该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。

关键词: 杆状病毒转移载体, 绿色荧光蛋白, 斜纹夜蛾, 真核表达

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2005年03月04日

【期刊论文】绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞菌在越冬水体的饥饿存活及复苏

陆承平, 张庆华

ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA, 2002, (5): 465~471,-0001,():

摘要

将绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞菌(Ah4332GFP)置模拟越冬水体(8 —10 ℃)内,进行饥饿存活试验,用三种计数方法检查水体中的细菌数量变化。在41d后平板计数法(PC)降至0,而细菌总数法(DC)和活菌直接计数法(DVC)结果相似,只是DVC计数结果低于细菌总数1—2个数量级。显示细菌已经变成活的非可培养(Viable but nonculturable,VBNC)状态。复苏试验表明,升高温度、添加鱼血清或新鲜培养的Ah4332GFP细菌上清及通过兔肠管结扎,均使VBNC状态的Ah4332GFP得到复苏。荧光显微镜和电镜观察处于可培养和VBNC状态的Ah4332GFP,后者的细菌细胞比前者体积明显缩小,形态由杆状变成了球形,但细胞膜和细胞壁是完整的,不是细菌L型。

关键词: 绿色荧光蛋白, 嗜水气单胞菌, 饥饿存活, 活的非可培养状态, 复苏

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2010年01月07日

【期刊论文】绿色荧光蛋白标记阿特拉津降解基因工程菌的特性

王慧, 刘春, 黄霞

环境科学,2006。27(7):1439~1443,-0001,():

摘要

通过转化绿色荧光蛋白基因质粒,对阿特拉津降解基因工程菌进行标记。转化后,绿色荧光蛋白在细胞内表达情况良好。在含抗生素的LB培养基中,绿色荧光蛋白的表达水平高于LB培养基和基础培养基。在细胞生长的稳定期,绿色荧光蛋白表达水平高于停滞期和对数生长期。绿色荧光蛋白基因质粒转化和表达,不会对基因工程菌原有的降解能力产生影响,而且绿色荧光蛋白的表达水平和降解活性存在接近线形的正相关关系。荧光蛋白标记细胞投加到反应器活性污泥中,会以2种状态存在:游离态和附着态,而且初期游离态细胞的数量大于附着态细胞的数量。

关键词: 基因工程菌, 绿色荧光蛋白, 阿特拉津, 降解

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