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2011年03月28日

【期刊论文】鸡bcl-2表达质粒的构建及其对转染细胞凋亡的影响

张书霞, 步志高, 陈万芳

中国农业科学,13(6):88~94,-0001,():

摘要

构建了CMV驱动及牛生长激素polyA加尾信号修饰的bcl-2cDNA真核表达质粒pCDCB1。随后,采用脂质体转染方法,将扩增并纯化的pCDCB1转染至培养的SPF鸡胚次代单层成纤维细胞(CEF)内,96h后收集全部贴壁及上清脱落细胞,用Dotblot检测bcl-2的表达,用流式细胞术测定其细胞凋亡率。结果,pCDCB1转染后96h,bcl-2在CEF中呈高度表达;CEF平均凋亡率为1.14%,明显低于转染空白载体质粒的对照组7.64%的凋亡率,DNA合成期(S期)细胞为21.58%,也低于对照组。结果证实鸡bcl-2的表达可显著抑制体外培养CEF,亡进程,其效应与细胞DNA合成和增殖无关。

关键词: bcl 2, cDNA, 真核表达质粒, 转染, 细胞凋亡

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2010年12月16日

【期刊论文】A族链球菌表面新发现蛋白Fba真核表达质粒的构建及其诱导的免疫应答①

魏林, 李彩虹, 马翠卿, 王锦②

中国免疫学杂志,2007,23(9):835~838,-0001,():

摘要

目的:构建新发现的A族链球菌(GAS)表面蛋白Fba 的真核表达质粒,并将其以及Fba蛋白、M 蛋白分别免疫小鼠,对它们诱导的体液免疫及细胞免疫应答进行评价分析。探讨Fba 蛋白作为GAS候选疫苗的可能性。方法:以SSI-9菌株(GASM 1血清型标准株)作为模板,采用PCR方法扩增Fba基因,测序正确后克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1/fba;将雌性CD1小鼠随机分成6组,分别为Fba蛋白免疫组、M 蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba+Fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照及PBS对照组。EL ISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平;脾细胞增殖试验检细胞增殖水平,并用流式细胞术检测小鼠体内CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞的变化。试验结果经SPSS10. 0统计处理。结果:成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/fba;质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以Fba蛋白免疫组增高最为明显,其次为Fba质粒蛋白混合免疫组及Fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示:pcDNA3.1/fba免疫组增殖水平明显高于其它组,流式细胞检测结果与此一致,并显示以CD4+ T细胞水平升高为主,CD8+ T细胞水平在各组别之间也有一定的差异。结论:(1) Fba 蛋白与M 蛋白一样均能有效地诱导机体产生抗体,提示Fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。(2)成功构建了Fba蛋白的真核表达质粒pcDNA3. 1/fba,且该重组质粒能有效地诱导抗链球菌所需的抗体,并能增强CD4+ T 细胞、CD8+ T细胞的增殖功能。

关键词: A族链球菌(, GAS), Fba蛋白, 真核表达质粒, 免疫

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2006年07月06日

【期刊论文】人胰岛素样生长因子-1真核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达

陈世益, 张鹏, 陈疾忤, 卫宏图

中国运动医学杂志,2005,24(1):1~13,-0001,():

摘要

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(hlGF-1)真核表达质粒DcDNA3,1(一)/hlGF-1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性。方法:应用DNA重组方法将编码hlGF-1cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(一)中,构建peDNA31(一)/hlGF-1真核表达质粒;应用阳性脂质体介导的基因转染技术,将真核表达质粒DcDNA3.1(一)/hlGF-1瞬时转染C2C12成肌细胞中;采用RT-PCR及免疫组化染色等方法检测hlGF-1基因在成肌细胞中的表达情况;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hlGF-1的生物活性。结果:将构建好的真核表达质粒DeDNA3.1(一)/hlGF一1转染成肌细胞后,hlGF-1mRNA及蛋白表达水平明显增高;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性。结论:成功构建了真核表达质粒oeDNA3.1(一)/hlGF-1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hlGF-1蛋白的表达,所表达出hlGF-1蛋白具有生物学活性。

关键词: 人胰岛素样生长因子-1, 真核表达载体, 成肌细胞

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2009年11月03日

【期刊论文】含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义

周岐新, 章涛, 杨贵忠, 袁野, 万敬员, 杨俊卿, 蒋建新, 周岐新*

解剖学报, 2007, 38(2):173~177,-0001,():

摘要

目的构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。方法 采用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、Sa/I相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测。结果 经酶切和测序证实重组赝粒构建正确,并在转染的293细胞巾获得hPPAR6的高效表达。结论 成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒。

关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体δ, 基因克隆, 真核表达 逆转录-聚合酶链反应

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2009年11月03日

【期刊论文】携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

周岐新, 章涛, 杨贵忠, 袁野, 李苌清, 万敬员, 蒋建新

中国药理学通报,2007,23(3): 413~417,-0001,():

摘要

目的 构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αahPPARa)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARa受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHI、SalI双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRE52-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα綦因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果 经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论 成功构建重组质粒phPPARa-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。

关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体d, 基因克隆, 真核表达

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2009年10月24日

【期刊论文】家蝇抗菌肽Cecropin-His6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建

朱家勇, 徐建华, 朱家勇*, 金小宝, 许琴英

生物技术,2005,15(1):3~7,-0001,():

摘要

克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin-His_6融合基因,构建其真核表达载体,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA,RT-PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列,将其克隆至pUCm-T载体进行序列测定;然后用含6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin-His_6融合基因,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1(+)中;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明,RT-PCR扩增得到约230bp的目的cDNA片段,与Genebank中报道的家蝇Cecropin cDNA序列存在一个无义变异差异(Lys:AAG→AAA);6×His标签成功融合到Cecrapin的C端。Cecropin-His_6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。

关键词: 家蝇, 抗菌肽, 基因克隆, 生物信息学分析, 真核表达载体

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2009年08月31日

【期刊论文】柯萨奇病毒B组3型中国分离株VP1基因真核表达系统的克隆

钟照华, 田野, 赵铁强, 黄建林, 安毅, 唐伟, 沈景霞, 钟学宽, 孟繁超, 黄永麟, 鲁凤民, 叶鸿瑁

中国地方病学杂志,1999,18(3):169~171,-0001,():

摘要

目的 探讨构建柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因疫苗的可行性。方法 应用逆转录PCR技术扩增CVB3中国分离株VP1基因,通过TA克隆法构建pCR2.1-CVB3VP1,将CVB3VP1亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,并进行酶切和测序鉴定。结果 发现CVB3的中国分离株与Nancy株的VP1基因基本一致,均编码293个氨基酸,其中有59处核苷酸存在变异,但仅改变了10处氨基酸编码,证实克隆的片段为CVB3VP1基因,表达载体为pCEP4。结论 实验成功地构建了CVB3中国分离株的真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,为CVB3基因疫苗的研究奠定了基础。

关键词: 柯萨奇病毒B组3型, VP1基因, 真核表达系统

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2009年08月31日

【期刊论文】柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达和鉴定*

钟照华, 田野, 李呼伦, 关欣, 赵文然, 赵铁强, 谷鸿喜, 孟繁超

微生物学杂志,2001,4(21):13~14,-0001,():

摘要

将克隆的CVB3 VP1基因亚克隆至真核表达载体pCEP4构建CVB3 VP1的真核表达质粒pCEP4CVB3 VP1。pCEP42CVB3 VP1转染HeLa细胞,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白。本研究为CVB基因疫苗的研究提供了实验依据。

关键词: 柯萨奇病毒B组3型, 真核表达 中和抗原

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2009年05月12日

【期刊论文】bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定*

刘霆, 席亚明, 刘霆Δ, 孟文彤, 汪宇辉, 顾玲, 陆晓茜, 龚玉萍

四川大学学报(医学版),2005,36(4):460~463,-0001,():

摘要

目的 构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterfering RNA, siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs, shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。

关键词: 慢性髓细胞性白血病bcr/, abl融合基因真核表达载体RNA干扰K562

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2009年05月12日

【期刊论文】抗mdrl RNA干扰真核表达载体的构建

刘霆, 顾玲m刘霆△, 龚玉萍, 王玉芳, 杨志梅, 席亚明

四川生理科学杂志,2005,27(1):6~9,-0001,():

摘要

目的:构建抗mdr1 RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdrl的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgen~il.1栽体中,转化大肠杆菌DH5a,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:用PstI和Sail酶切鉴定质粒Pmdrlshl、Pmdrlsh2、Pmdrlsh3均符合设计要求。测序证实序列完全正确。结论:通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdrlshl、Pmdrlsh2、Pmdrlsh3插入位点正确,与设计序列一致,预期可用于逆转mdrl所致耐药。

关键词: mdrl基因, RNA干扰, 真核表达载体

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2006年10月10日

【期刊论文】BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性

郭雄, 张银刚, 师常宏, 邹爱民, 许鹏

中南大学学报(医学版),2005,30(1)16~20,-0001,():

摘要

目的:构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法:用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS27细胞,用荧光显微镜检测和Western blotting分析其在COS27细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一步检测融合蛋白的生物活性。结果:经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/LEGFP构建成功。转染COS27细胞后,荧光显微镜和Western blotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论:基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。

关键词: BMP2, 基因转染, 真核表达 生物活性

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2006年11月15日

【期刊论文】HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

方建培, 刘四喜, 徐宏贵, 陈国华, 黄绍良

中国实验血液学杂志,2005;13(3):464~467,-0001,():

摘要

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体,并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PCR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2/EcDNA,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,构建成HLA-E真核表达载体pcDNA3.1(+)/A2E,然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞,最后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测,以观察}玎LA-E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示,HLA-E分子在经pcDNA3.1(+)/A2E转染的靶细胞表面获得表达(27.76%),而经空载体pcDNA3.1(+)转染的靶细胞则未获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)/A2E真核表达载体,并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达,为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。

关键词: HLA-E, 真核表达载体, K562细胞, 先导肽

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2006年06月30日

【期刊论文】杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

朱江, 胡兆丽, 王文兵, 朱江*, 李新平, 沈颂东

生物工程学报,2005,21(4):530~533,-0001,():

摘要

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)的重组病毒,以该病毒日本c3株基因组DNA为PCR扩增模板,根GenBank SphMNPV中国G2株基因序列,设计了两时引物分别扩增多角体蛋白基因的5’端侧翼序列(舍启动子)和3’端侧gf/- 列(舍终止子),将这两个片段依次克隆于pUCl8质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SphMNPV基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选。获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SphMNPV-gfp,SphMNPV-gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达:该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。

关键词: 杆状病毒转移载体, 绿色荧光蛋白, 斜纹夜蛾, 真核表达

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2005年03月08日

【期刊论文】旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达*

诸欣平, 徐旭娜, 诸欣平**, 杨雅平, 杨静, 张路平

中国寄生虫病防防治杂志,2003,2(16):71~73,-0001,():

摘要

目的 在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3.1/Ts87,为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础。方法 将重组质粒pcDNA3.1/Ts87经脂质体L ipofectam ine介导,体外转染真核细胞COS7,通过细胞免疫组化,细胞裂解物的SDS-PAGE电泳和Western-blot分析检测表达产物。结果 重组质粒能够在COS7中表达出约38ku的目的蛋白,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。结论 构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7 中成功表达。

关键词: 旋毛虫, COS7细胞, 重组质粒, 真核表达

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2008年01月29日

【期刊论文】小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

沈丽佳, 方唯意, 谢思明, 何滢, 蒋会勇, 赵彤

南方医科大学学报(J South Med Univ) 2006; 26(2),-0001,():

摘要

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA.克隆AT载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xhol双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与pcDNA3.1/MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结呆与GenBank提供的已知序列(NM_138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3.1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较.100%同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3.1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

关键词: 淋巴瘤, A20细胞株, mCD99L2, 基因克隆, 真核表达载体

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