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2006年11月02日

【期刊论文】单纯疱疹病毒胸腺激酶基因系统抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的研究

葛坚, 王继兵, 刘炳乾, 黄冰, 魏雁涛

中华眼科杂志,2006,42(3):212~217,-0001,():

摘要

目的研究单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-tk)基因系统对人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTFs)增殖的抑制作用及其作用机制。方法 构建含HSV2tk基因的逆转录病毒载体pL(tk)SN并转入包装细胞系PT67进行病毒包装,G418筛选抗性克隆并扩大培养收集病毒上清,测定病毒滴度。透射电镜观察鉴定病毒颗粒;聚合酶链反应(PCR)技术鉴定tk基因在病毒基因组中的整合。用病毒感染HTFs细胞,G418筛选并扩大培养,逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)技术和免疫印迹法检测tk基因的表达;加不同浓度前药更昔洛韦(GCV)后,以MTT法检测tk基因对HTFs细胞增殖的抑制作用;采用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测凋亡细胞;电镜观察细胞形态学改变。结果酶切鉴定结果显示成功构建了逆转录病毒载体pL(tk)SN,电镜下包装细胞产生的病毒颗粒呈椭圆形,直径约100nm;病毒基因组中,PCR扩增出了tk基因;测得病毒滴度为4×107cfu/ml;被转染的HTFs细胞,用RT2PCR及免疫印迹法检测到tk基因在mRNA与蛋白水平均有表达;HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞增殖的抑制作用表现为剂量依赖性,5×10-3g/L的GCV作用5d可将细胞全部杀死,IC50为6×10-4g/L,HSV2tk2GCV系统对HTFs细胞的杀伤机制表现为坏死与凋亡,凋亡率随GCV浓度的升高而增加。结论 HSV2tk基因系统能有效抑制人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖,作用机制表现为细胞的坏死与凋亡。(中华眼科杂志,2006,42:2122217)

关键词: 单纯疱疹病毒属,  胸苷激酶,  更昔洛韦,  眼  成纤维细胞

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2006年11月03日

【期刊论文】广州开角型青光眼家系致病基因定位与功能初步研究

葛坚, 魏雁涛, 段山, 卓业鸿, 凌运兰, 林明楷, 高前应

中华眼科杂志,2005,41(12):1068~1075,-0001,():

摘要

目的鉴定常染色体显性遗传家族性开角型青光眼家系(GZ11)致病基因并探讨其致病机制。方法应用全基因组扫描、连锁分析、核苷酸直接测序法筛查GZ11家系的致病性基因突变,进一步利用体外基因转染技术,观察突变型基因在小梁细胞中的表达、分布及对细胞凋亡的作用。结果GZ11家系所有患者均存在myocilin基因第三外显子Pro370Leu杂合突变(16/16),而家系正常人中均未检测到该突变(0/8)。小梁细胞体外转染野生型和突变型myocilin基因后,经免疫印迹法检测证实,培养上清液中突变型myocilin蛋白的细胞外分泌较野生型明显减少;荧光免疫组化检测结果证实野生型myocilin蛋白在小梁细胞内呈点状、弥漫分布;而Pro370Leu突变型myocilin蛋白以积聚体形式存在于胞质内;经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较野生型转染组及对照组轻度升高。结论突变型(Pro370Leu)myocilin基因为GZ11家系的致病基因,突变型(Pro370Leu)myocilin蛋白在小梁细胞内以积聚体形式存在,可能是由于蛋白质错误折叠所致,并可能诱导小梁细胞凋亡。

关键词: 青光眼, 开角型,  细胞支架蛋白质类,  眼蛋白质类,  糖蛋白类,  蛋白质错误折叠

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