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2011年03月28日

【期刊论文】水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备*

张炜, 程彦伟**, 李亮**, 沈嵘, 齐耀程, 刘晓宇, 王宁, 张炜***

生物化学与生物物理进展,2008,35(9):1077~1083,-0001,():

摘要

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%。重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20000效价的多克隆抗体。Western blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白。

关键词: LRR型类受体蛋白激酶,, 水稻,, 原核表达,, 多克隆抗体

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2010年12月07日

【期刊论文】贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的克隆及原核表达水

王嘉福, 代新兰., 冉雪琴, 王嘉福.**

China Poultru Vol.30 No.72008,-0001,():

摘要

采用特异性引物自贵州黑羽乌骨鸡胃部组织克隆了Ghrelin的基因,基因全长12330bp,含有4个外显子,3个内含子。采用RT—PcR技术,获得了Ghrelin cDNA版式段(563bp),Il序列分析推测,通过可变剪切可产生两mRNA,cDNA编码区与基因组中的编码区完全一致。黑羽乌骨鸡Ghrelin基因与已知鸡种比较有13~18个碱基不同,相似性为99.1~99/3%,但其氨基酸序列完全一样,表明禽类 Ghrelin。多肽高度保守。将其 Ghrehn编码区亚克隆到原II核表达载44kpTYBll中,经序列测定碱基序列正确,获得重组质:pTYBll/G。在IPTG的诱导下,重组质粒在大肠杆菌ER2566中获得表达。当ODm=0.5,IPTG浓度1mmol/L,诱导5小l时的表达量最高,融合蛋白占细胞总蛋白40%。采用几质结合的预装柱对表达产物进行l纯化,产率约为5 mg/L培养液。

关键词: 乌骨鸡, Ghrelin基因, 原核表达

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2010年11月18日

【期刊论文】番茄衰老相关蛋白SENU3在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

王傲雪, 赵永娟 王傲雪, 贾琪, 华子春

植物生理学通讯,2005,41(5):208~110,-0001,():

摘要

研究了SENU3蛋白表达载体的构建、大肠杆菌表达、纯化及其抗体的制备。

关键词: 番茄衰老相关蛋白SENU3, 原核表达 割胶., 电洗脱法, 多克隆抗体

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2009年10月21日

【期刊论文】VEGFR-3反义多肽的原核表达及其意义

张雅洁, 李书华, 王燕菲, 李杰荣

广州医学院学报,2004,32(2):10~13,-0001,():

摘要

目的:将血管内皮生长因子受体3胞外第二免疫球蛋白区(VEC.FR-3 2-lg)的反义基因在体外进行原核表达,并将产物进行生物活性鉴定。方法:构建VECFR-3 2-lg反叉基因的原核表达载体,经过原核表达、亲和层析及蛋白酶切后获得VEGFR-3 2-lg的反义多肽,用MrIT法进行活性鉴定、结果:获得VEGFR-3 2-lg的反义多肽,MrIT法证明VECFR-3 2-lg的反义多肽具有较强生物学活性(细胞增殖抑制率可达68.7%)。结论:通过原核表达成功获得VECFR-3的反义多肽,为研究和利用反义多肽提供了实验理论依据。

关键词: VECFR-3 2-lg, 反义多肽, 原核表达

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2009年10月21日

【期刊论文】VEGFR-3 2-Ig反义多肽的原核表达及生物活性鉴定

张雅洁, 玉梅, 李书华, 李冰, 张惠球

Journal of Modern Clinical Medical Bilengineering2003,9(3):228~239,-0001,():

摘要

目的将VEGFR -3 2-Ig的反义基因在体外进行原核表达,并将产物进行生物活性鉴定。方法构建VEGFR-3 2-Ig反义基因的原核表达载体,经过原核表达、亲和层析及蛋白酶切后获得将VEGFR -3 2-Ig的反义多肽,用MTI'法进行活性鉴定。结果获得VEGFR -3 2-Ig的反义多肽,MTI'法证明VEGFR -3 2-Ig的反义多肽具有较强生物学活性。结论成功获得VEGFR -3 2-Ig的反义多肽,为研究和利用反义多肽提供了实验理论依据。

关键词: 反义多肽 原核表达 活性鉴定

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2009年08月31日

【期刊论文】柯萨奇B1 病毒V P1 基因在大肠杆菌中的表达

钟照华, 赵铁强, 田野, 韩福生, 梁瑛娟, 谷淑燕, 皮国华, 孟繁超

中国地方病学杂志,2002,21(1):5~7,-0001,():

摘要

目的 在大肠杆菌中表达柯萨奇B1(CVB1)病毒VP1蛋白。方法 用限制性酶切方法将CVB1V P1 基因从pMD18-T-VP1上切下,连接至pQ E30构建原核表达系统pQ E30-VP1。经酶切和PCR 验证后转化至大肠杆菌BL 21(DE3),用IPTG 诱导目的基因表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blot 检测VP1 蛋白的表达。结果 酶切、PCR 证明构建的原核表达系统携带方向正确的CVB1 VP1 基因。SDS-PA GE 和Western-blot 实验均可于33.0kDa 处见到目的条带。结论 CVB1 VP1 基因在大肠杆菌的成功表达为开发新的血清学检测试剂提供了基础。

关键词: 柯萨奇病毒B, 基因, 病毒, 大肠杆菌, 原核表达

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2009年06月09日

【期刊论文】IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定

李虹, 李明远, 蒋忠华, 吕梅励, 张林△

四川大学学报(医学版),2004,35(6):753-756,-0001,():

摘要

目的 构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠lL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法 首先采用RT-PCR获得小鼠lL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠lL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-ILl8-PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实,lL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗lL-18的特异性抗体所识别。结论 lL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。

关键词: IL-18绿脓杆菌外毒素重组免疫毒素原核表达

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2009年06月09日

【期刊论文】免疫毒素lL-18-CN38原核表达载体的构建及其鉴定*

李虹, 李明远, 吕梅励, 蒋忠华, 张林

航天医学与医学工程,2005,18(6):395~398,-0001,():

摘要

目的 构建绿脓杆菌外毒素CN38融合鼠lL-18基因的原核表达载体,并鉴定其产物在大肠杆菌中的表达。方法 首先经逆转录聚合酶链反应(OH-CAO)获得小鼠lL-18基因,再通过酶切及连接反应,构建小鼠lL-18与CN38融合基因的原核表达载体COIL-lL18-CN38,重组载体经CAO、限制性内切酶及721序列测定证实连接片段正确后,转染感受态大肠杆菌JL21,经lCH3诱导表达,表达产物用B7B-C13N和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果 成功构建了lL-18-CN38免疫毒素的原核表达载体,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗lL-18的特异性抗体所识别。结论获得了lL-18-CN38融合基因在原核系统的表达,为进一步研究其对H51细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。

关键词: lL-18-CN38, 重组免疫毒素, 原核表达 基因构建

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2009年02月11日

【期刊论文】鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达与产物活性分析

王旻, 王颖, 边杉, 张婷婷, 赵艳景, 吴梧桐, 叶波平

海洋科学,2004,28(6):37~41,-0001,():

摘要

构建了鲨肝刺激物质类似物基因片段的原核表达载体质粒(pET-sHSS),转化大肠杆菌后通过IPTG诱导获得原核表达产物,并利用凝胶层析方法对表达产物进行了分离纯化;进一步利用MTT比色法研究了该重组产物对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖影响。结果表明,在1mmol/L的IPTG的诱导下,鲨肝刺激物质类似物基因片段在大肠杆菌BL21菌株中获得表达,表达产物的相对分子质量大小约为17500u,占茵体可溶性蛋白总量的38%左右;纯化后的产物在低浓度下(<50ng/L)具有明显刺激SMMC7721细胞株增殖的活性,高浓度下(>100ng/L)则明显抑制该肿瘤细胞株的生长,与天然鲨肝刺激物质的生物活性类似。

关键词: 鲨肝刺激物质类似物, 原核表达 cDNA克隆, 生物活性

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2007年05月28日

【期刊论文】猪α干扰素原核表达载体的构建及表达

崔保安, 刘占通, 舒畅, 金喜新, 陈红英, 杨明凡, 魏战勇

河南农业大学学报2006年8月第40卷第4期/Journal of Henan Agricultural University Aug., 2006, Vol. 40,No. 4,-0001,():

摘要

以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-aZ为模板,PCR扩增杂种猪d干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了猪d干扰素原核表达载体pFT-IFN-a,实现了猪d干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS- PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特异性的条带.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在.经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%.

关键词: 猪a干扰素, 原核表达 Western - blotting

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2007年05月31日

【期刊论文】人NMDA受体主亚基M3-M4环基因片段的高效表达、纯化与鉴定

孙长凯, 张玉梅, 范明, 李伍举, 刘淑红, 赵杰, 韩大跃, 王嘉玺

中国生物化学与分子生物学报2003年10月19(5): 588-593/Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,-0001,():

摘要

用基因工程方法获得人N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体主亚基M3-M4环靶片段,以此为免疫原,用于进一步免疫原性及相关应用研究。自人脑胶质瘤组织中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出人NMDA受体主亚基M3-M4环的基因片段,并按照计算机辅助原核表达载体pBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法,将其进行优化改构。将目的基因克隆到pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,升温诱导表达,从蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况,通过制备性SDS-PAGE进行纯化,从相对分子质量、免疫反应性、肽质谱指纹分析等方面进行鉴定。结果表明,成功构建了人NMDA受体主亚基M3-M4环的原核表达载体(命名为pBV-NR1L3),通过基因优化,实现了高效表达。凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白29%,重组肽纯度达95%以上。

关键词: 人N-甲基-D-天冬氨酸受体, 原核表达 纯化与鉴定

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2006年11月16日

【期刊论文】恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究*

詹希美, 赖延东, 郑小英, 李秀英, 何蔼, 吴瑜, 李卓雅

中国人兽共患病杂志,2004,20(10):829-832,-0001,():

摘要

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56。转化宿主茵BL21(DE3),JPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白。亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-StY6经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白。为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。

关键词: 恙虫病东方体Karp株, 56kD表膜蛋白, 原核表达 酶联免疫吸附试验

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2006年11月01日

【期刊论文】华支睾吸虫成虫转录辅激活因子基因在原核细胞中的克隆、表达及其生物功能分析

余新炳, 张咏莉, 余新炳*, 吴德, 吴忠道, 毕惠祥

中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23(1):18~23,-0001,():

摘要

目的构建华支睾吸虫成虫转录辅激活因子(transcriptionalcoactivator,Tc)基因(TC基因)原核重组质粒,进行原核表达、鉴定及生物功能分析:方法根据TC基因已知序列设计1对引物,从华支睾吸虫成虫cDNA文库中扩增TC基因片段;将目的基因进行聚合酶链反应(NR),其产物和空质粒pGEX-4T-1.pET30a(+)同时用限制性内切酶BamHJ、SalI双酶切,纯化回收后连接并转化大肠埃希菌(E.coliBL21)将构建的重组质粒pGEX-4T-1-TC和pET30a(+)-TC分别经双酶切、PCR及测序鉴定后在大肠埃希菌BL21中诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹祛(Westemblotting)鉴定其表达效果。用亲和层析法纯化重组质粒pET30a(+)-TC表达产生的组氨酸重组蛋白(His-TC)结果构建了TC基因原核重组质粒pGEX-4T-1-TC和pFT30a(+)-Tc0sPS-PAGE结果表明TC基因在大肠埃希菌BL2l系统获得高效表达,其重组蛋白分子量与理论值相符:Westemblotting结果表明重组质粒pGEX-4T-1-TC表达的谷胱甘肽硫转移酶(GST)重组蛋白(GST-TC)可被华支睾吸虫免疫兔血清识别,具有免疫反应性。纯化的TC基因的组氨酸(His)重组蛋白(His-TC)经sDSPAGE显示单一条带:结论通过生物信息学方法由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出TC基因,并成功予以克隆、表达及纯化。

关键词: 华支睾吸虫, 转录辅激活因子基因, 基因重组, 基因克隆, 原核表达

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2006年10月27日

【期刊论文】人颗粒酶B基因的克隆、蛋白纯化及表达分析

朱振宇, 李秀英, 赖延东, 夏良平, 曾宗渊, 张海涛, 冯哲玲, 李民友

《现代免疫学》,2004,24(6):486~489,-0001,():

摘要

TIL具有抗肿瘤的活性,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用。本实验拟扩增GrB全序列,构建GrB的原核表达载体,从而建立其原核表达体系,获得高效表达的重组GrB,纯化蛋白。用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞,并抽提RNA,RT2PCR方法获得GrB的全长,并重组到pGEX24T21中,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定,IPTG诱导pGEX2GrB转化的BL21菌,大量纯化表达产物,并通过SDS2PAGE、Western blot分析表达产物,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段,GrB准确克隆入pGEX24T21,成功的构建pGEX2GrB,经诱导表达出与GST融合的蛋白,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带,并能与GrB特异性抗体结合。体外实验表明,GrB能抑制Hep2细胞的增殖。成功构建了pGEX2GrB,并成功表达、大量纯化GrB蛋白,其能够抑制Hep2细胞的增殖。

关键词: 颗粒酶B, 淋巴细胞, 原核表达 GST融合蛋白

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2005年02月24日

【期刊论文】鸡白介素18基因原核表达质粒构建

黄青云, 温纳相, 陈荣光, 曹素芳, 陈金顶

动物医学进展,2003,24 (5):78~80,-0001,():

摘要

根据已发表的江西土鸡白介素218(Ch IL-18) cDNA编码基因序列设计引物, 用PCR技术从pMDCh IL-18质粒扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白基因,重组于pBV 220表达载体上,将重组质粒转化大肠杆菌JM 109 (DE3),转化子经温度诱导的表达产物,SDS-PA GE 电泳鉴定约2万,N端开头15个氨基酸序列测定分析,证明获得了鸡IL-18成熟蛋白,为今后深入研究鸡IL-18的生物学特性及其临床应用打下了基础。

关键词: 鸡IL 218, PCR, 原核表达

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2005年03月08日

【期刊论文】免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达★

诸欣平, 杨静, 诸欣平**, 杨雅平, 周蕾, PascalBoireau, 詹斌, 冯建军, Hotez Peter

中国寄生虫病防防治杂志,2003,1(16):7~9,-0001,():

摘要

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入PET228a(+)表达载体,IPTG诱导表达后用SDS2PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87;成功构建重组表达质粒PET228a(+)/Ts87。诱导表达该融合蛋白,SDS2PAGE电泳表明,其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白,与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。

关键词: 旋毛虫, 免疫筛选, cDNA克隆, 原核表达

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2005年02月25日

【期刊论文】恶性疟原虫带7蛋白家族蛋白cDNA的克隆及表达产物特征分析△

王恒, 张玲, 张连惠, 王海一, 王恒#

Acta Acad Med Sin, 2003, 25(2):181~184,-0001,():

摘要

目的 分离、克隆恶性疟原虫带7蛋白家族蛋白编码基因pfstom,并对其功能进行初步研究。方法 根据国际恶性疟研究公共数据库释放的已完成序列数据(CoDing Sequence,CDS数据)设计引物,用RT-PCR方法从恶性疟原虫中国海南株(FCCl/HN)中得到其带7蛋白家族蛋白基因cDNA--pfstom。应用多种软件对其结构功能、基因进化特征以及同源性分析。用pET30a系统表达其具有stomatin样蛋白结构域的C端蛋白,免疫新西兰大白兔并纯化抗体。Westem杂交检测其在FCCl/HN表达情况。结果 pfstom基囚编码区全长1125bp,编码374个氨基酸,C端具有和人红细胞整合膜蛋白带7蛋白家族中stomatin样蛋白类似的结构。进化特征分析显示:在带7蛋白家族中,Pfstom蛋白与stomatin样蛋白亲缘关系较近。Western杂交发现Pfstom蛋白在FCC1/HN的滋养体期呈期特异性表达,在与膜相关和与膜不相关的感染红细胞蛋白提取物中都存在。结论 Pfstom是带7蛋白家族蛋白,在FCC1/HN红内期的滋养体期呈特异性表达,环状体期不表达,该蛋白是膜相关蛋白。

关键词: 带7蛋白, stomatin样蛋白, 恶性疟, 原核表达

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2009年05月11日

【期刊论文】L-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定*

张林, 李虹, 李明远, 蒋忠华, 吕梅励, 张林△

四川大学学报(医学版),2004,35(6):753-756,-0001,():

摘要

目的 构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法 首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL 18-PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL-1,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PA GE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果 酶切分析、PCR鉴定和DNA 测序等证实,IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-18 的特异性抗体所识别。结论 IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。

关键词: L-18绿脓杆菌外毒素 重组免疫毒素 原核表达

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2010年01月03日

【期刊论文】TAT-GFP-Erβ融合蛋白的原核表达与鉴定

石建党, 于林, 王春雨, 杨睿, 王亮, 张琚

南开大学学报(自然科学版),2008,41(4):55~58,-0001,():

摘要

从前列腺中提取总RNA,RT-PCR获得Erβ基因,将其联人pEGFP载体,得到重组质粒pEGFP-Erβ,再将上述质粒的GFP-Erβ融合蛋白,用Western Blot鉴定纯化的融合的免疫原性。用纯化的蛋白转导事先转染ERE-Luc报道质粒的Hela细胞,用Luciferase Assay鉴定转导蛋白的生物学活性。证明TAT-GFP-Erβ蛋白具有完整的生物活性。

关键词: TAT, 蛋白转导, 原核表达 雌激素受体β

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