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2010年12月07日

【期刊论文】猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达*

王嘉福, 陆承平

Vil.43 No.1 February 2003,-0001,():

摘要

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体(pro-ST)和Lt的B亚单位(LTB)成熟多肽的序列,再通过套式PcR将pro-ST编码序列3'端和LTB编码序列5’端融合,并置于同一词读框内,得到SL和LTB的融合基因,将此序列克隆到pGEM-T质粒中,序列分析后,亚克隆到表达载体pOE30中,在大肠杆菌细胞中得到表达,表达的融合蛋白同时具有田和LTB的抗原性,且无ST和LT的生物毒性。

关键词: 猪大肠杆菌,, 肠毒素,, 基因融合

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2010年12月07日

【期刊论文】猪水肿病大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型突变体新基因的分子特征

王嘉福, 冉雪琴, 王红珍, 艾虎, 吴拥军, 王嘉福*

Vol.44 No.2 April 2004,-0001,():

摘要

从仔猪水肿病样品中分离的一株大肠杆菌菌株NP962l 抽提染色体DNA,构建NP962l 的总DNA文库,经菌落原位杂交筛选、限制酶酶切和southem 印迹等分析,获得含有志贺样毒素基因的重组质粒,核苷酸序列分析表明,该基因的A亚基与SLt-IIes的同源性为97.6%-98.1%,与SLT-IIc\SLT-IId及EHEc 0157:H7产生的SLT-II的A亚基之司的同源性分别为93.1%、93.0%和92。9%;B亚基与SLT-lles的同源性为99.62%-100%,与SLT-iiC\slt:IId及slt-II的同源性分别为81.5%、81.15和81.5%;与29种已知序列的SKT-II slt-i及志贺毒素stx进行聚类分析,结果证实大肠杆菌NP9621菌株中的志贺样毒素基因属于一种新的slt-II亚型。SLT-IIE/NP962l的A亚基与其它slt-IIe之司存在7-9个氨基酸的差异B亚基的氨基酸序列完全相同,与A亚基毒力活性密切相关的氨基酸分别为Thr4、Glu167 Arg170 和Arg176。

关键词: 大肠杆菌,, 猪水肿病,, 志贺样毒素突变体基因

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2009年10月21日

【期刊论文】大肠杆菌可溶性表达人碱性纤维细胞生长因子的研究

洪岸, 孙晋华, 洪岸*, 张玲, 孙奋勇, 宋照熙

微生物学报,2003,43(4):448~452,-0001,():

摘要

包涵体的形成与外源基因在大肠杆菌中的表达量高度相关,在适当的范围内,降低hbFCF在表达宿主BL21(DE3)plysS中的表达,成为实现高可溶性表达的关键。在不改变氨基酸序列的条件下,对hbFCF高表达菌株突变重组子起始密码ATC下游前3个密码子的摇摆碱基进行随机回复突变,共有7种组合,合成引物PCR扩增后,克隆至表达载体pET-3e,将重组子转导BL21(DE3)plysS后,IPTC诱导表达,发现其中1株有较高可溶性和活性的菌株。可见部分降低外源蛋白的表达量可以避免与减少包涵体的形成。

关键词: 可溶性表达,, 包涵体,, 人碱性成纤维细胞生长因子,, 大肠杆菌,, 回复突变

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2009年01月19日

【期刊论文】具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成反应过程*

李华钟, 李寅, 林金萍, 陈坚**

微生物学报,2001,41(1):16~24,-0001,():

摘要

以野生型大肠杆菌E. coliⅡ为宿主细胞,转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501,获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,并且能够重复使用的重组大肠杆菌E. coli Ⅱ21。该菌株经过甲苯处理后,能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中,提高L2谷氨酸浓度可促进GSH合成,但L2半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况,提出E. coliⅡ21细胞控制的GSH合成反应机理:由谷胱甘肽合成酶(GSH2Ⅱ)控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP,该反应是整个GSH合成反应的限速步骤,高浓度ADP可能会抑制GSH2 Ⅱ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L2丝氨酸-硼酸钾混合物,可以有效地防止GSH的进一步降解,反应3h后,GSH产量达到2310mmol/L(约711g/L)。

关键词: 谷胱甘肽,, 重组大肠杆菌,, 构建,, 生物合成,, 反应机理

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2009年01月19日

【期刊论文】生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建*

李华钟, 李寅, 林金萍, 陈坚**

微生物学报,2001,41(2):191~197,-0001,():

摘要

利用重组大肠杆菌Ⅱ21中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH2J7中的ATP生物合成酶系,构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加1mmol/LAMP和0105mmol/LNADH,即可启动酵母的酵解途径。提高耦合系统中的葡萄糖浓度,可促进GSH的合成。当葡萄糖浓度为400mmol/L时,系统内GSH浓度达到1014mmol/L(312g/L)。Mg2+缺乏时,耦合系统和外加ATP的非耦合系统均不能合成谷胱甘肽。耦合系统中Mg2+与ATP 形成螯合物,可能是导致耦合系统中GSH产量较低的原因。在耦合系统中补加Mg2+,反应6h时GSH浓度达到1413mmol/L(414g/L)。

关键词: 重组大肠杆菌,, 面包酵母,, 种间耦合ATP再生系统,, 谷胱甘肽,, 生物合成,, 构建

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2009年01月19日

【期刊论文】Streptoverticillium mobaraense谷氨酰胺转胺酶的表达、纯化和复性

李华钟, 唐名山, 王树英, 陈坚

食品与发展工业,2004,30(4):71、81、91,-0001,():

摘要

以基因组DNA为模板,利用PCR技术从茂原轮链丝菌(Streptoverticilliummobaraense)中扩增得到产成熟谷氨酰胺转胺酶MTG的结构基因mtg,克隆于表达载体pQE230T,构建成lac启动子控制下的His6融合表达质粒pMTG,将此重组质粒转化到受体菌E. coli M15中。对质粒稳定性的研究表明,E. coli M15在无选择压的情况下,于37℃连续转接5次,质粒丢失率仅有24%,说明质粒基本稳定。重组菌经IPTG诱导,表达的重组谷氨酰胺转胺酶占菌体总蛋白的18%,经SDS2PAGE分析,表达的蛋白质的分子质量为38ku,与预期分子质量相符。表达产物主要以包涵体的形式存在。细胞经超声破碎,离心取包涵体溶于8mol/L的尿素中,然后通过Ni2NTA亲和柱分离纯化和稀释法复性。目的蛋白的纯度可达95%以上。比酶活为1013U/mg。

关键词: 谷氨酰胺转胺酶,, Streptoverticilliummobaraense,, 大肠杆菌,, 纯化,, 复性

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2005年02月24日

【期刊论文】禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究

黄青云, 蒋文泓

畜牧兽医学报,1999,30 (3):267~272,-0001,():

摘要

以耐药标记的华农系禽多杀性巴氏杆菌5:A弱毒菌株(Chlr, Nors)与禽大肠杆菌O2弱毒菌株(Norr, Chls0作亲本,在DNase1始终存在的条件下,采用溶菌酶-EDTA法制备两亲本菌株原生质体后再生,原生质体形成率均90%以上,原生质体再生率为35.63%、50.93%。通过聚乙二醇-钙离子促融合剂系统,进行原生质体融合,成功地获得3株具有双亲本耐药性(Chlr, Norr)和双菌体血清型(5: A, O2)的融合菌株。它们的生化反应、菌体和菌落大小介于两亲本菌株之间,在肉汤培养中表现出双亲菌株的生长特性。经多次传代,表明3个融合株的上述性状是稳定遗传的。

关键词: 禽多杀性巴氏杆菌,, 禽大肠杆菌,, 原生质体融合

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2005年05月16日

【期刊论文】基因工程菌大肠杆菌JM109富集废水中镍离子的研究

李清彪, 邓旭, 卢英华, 孙道华, 黄益丽

生物工程学报,2003,19(3):344~348,-0001,():

摘要

利用通过基因工程技术所构建的在细胞内同时表达出高特异性镍转运蛋白和金属硫蛋白的基因工程菌富集水体中的镍离子。菌体细胞对Ni2+ 的富集速率很快,富集过程满足Langmuir等温线模型。与原始宿主菌相比,经基因改造的基因工程菌不仅最大镍富集容量增加了5倍多,而且对pH值、离子强度的变化及其它共存重金属离子的影响都呈现出更强的适应性。相比而言,Na+、Ca2+、Cd2+、Pb2+ 的影响较小,但Mg2+、Hg2+ 和Cu2+ 所引起的负面效应较大。进一步的实验表明基因工程菌对Ni2+ 的富集行为不需要外加营养物质

关键词: 大肠杆菌,, 镍离子,, 生物富集,, 废水处理

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