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2011年06月21日

【期刊论文】单核细胞化学吸引蛋白质1小分子干扰RNA人肾小管上皮细胞株的建立

严海东, 刘娜, 李雪竹

中华肾脏病杂志,2007,23(4):251~256,-0001,():

摘要

目的建立单核细胞化学吸引蛋白质1(MCP-1)小分子干扰RNA(siRNA)人肾小管上皮细胞株,并检测MCP-1 siRNA对人肾小管上皮细胞(HKC)MCP-1基因的抑制效应。方法针对人MCP-1 mRNA 67、116、142位点设计并合成3对MCP-1 siRNA序列。构建MCP-1特异性siRNA真核表达载体,以脂质体法瞬时转染至HKC。转染24h后分别应用实时定量RT-PCR及Westem印迹技术检测HKC内MCP-1 mRNA、蛋白表达,筛选出抑制效率最高的MCP-1 siRNA。以筛选出的MCP-1 siRNA序列构建慢病毒穿梭质粒。使用慢病毒穿梭质粒进行慢病毒颗粒的包装和生产,得到病毒液并确定其滴度。以病毒液感染HKC,筛选MCP-1 siRNA人肾小管上皮细胞株,并应用实时定量RT-PCR及Westem印迹技术检测HKc内MCP-1 mRNA、蛋白表达。结果成功建市MCP-1特异性siRNA人肾小管上皮细胞株。MCP-1 siRNA稳定转染能下调人肾小管上=皮细胞MCP-1 mRNA(68.49±6.38)%、蛋白(72.97±6.13)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论MCP-1特异性siRNA能高效抑制HKC内MCP-1基因表达。MCP-1 siRNA人肾小管上皮细胞株的建立为MCP-1基因功能及肾问质纤维化防治研究提供实验材料和依据。

关键词: 单核细胞化学吸引蛋白质1; RNA, 小分子干扰; 纤维化; 人肾小管上皮细胞; 转染

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2011年03月28日

【期刊论文】鸡bcl-2表达质粒的构建及其对转染细胞凋亡的影响

张书霞, 步志高, 陈万芳

中国农业科学,13(6):88~94,-0001,():

摘要

构建了CMV驱动及牛生长激素polyA加尾信号修饰的bcl-2cDNA真核表达质粒pCDCB1。随后,采用脂质体转染方法,将扩增并纯化的pCDCB1转染至培养的SPF鸡胚次代单层成纤维细胞(CEF)内,96h后收集全部贴壁及上清脱落细胞,用Dotblot检测bcl-2的表达,用流式细胞术测定其细胞凋亡率。结果,pCDCB1转染后96h,bcl-2在CEF中呈高度表达;CEF平均凋亡率为1.14%,明显低于转染空白载体质粒的对照组7.64%的凋亡率,DNA合成期(S期)细胞为21.58%,也低于对照组。结果证实鸡bcl-2的表达可显著抑制体外培养CEF,亡进程,其效应与细胞DNA合成和增殖无关。

关键词: bcl 2, cDNA, 真核表达质粒, 转染 细胞凋亡

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2011年06月07日

【期刊论文】转铁蛋白修饰的载基因前阳离子脂质体制备及其表达研究

何勤, 钟志容, 刘戟, 邓勇, 张志荣, 宋庆国, 何勤*

药学学报:2007,42(2):216-220,-0001,():

摘要

本文制备、优化转铁蛋白修饰的前阳离子脂质体,并研究其相关性质。通过薄膜分散膜挤压法制备空白前阳离子脂质体;以鱼精蛋白缩合质粒DNA与空白前阳离子脂质体作用形成载基因前阳离子脂质体(PLPD);转铁蛋白(transferrin,Tf)再与PLPD作用形成转铁蛋白修饰的载基因前阳离子脂质体(Tf-PLPD);中心组合设计优化制备工艺;以lacZ为报告基因转染人肝癌细胞株HepG2;测定形态、粒径、电位和转染效率。结果显示,PLPD形态近似于球体,平均粒径为(228.9±8.0)nm,多分散指数为0.122±0.020(n=3);zeta电位为(-25.08±2.50)mV(n=3),转染效率(12.18±3.80)mU•mg-1(protein)。Tf-PLPD平均粒径为(240±12)nm,多分散指数为0.150±0.030(n=3);zeta电位为(-24.10±2.50)mY(n=3);转染效率(24.26±2.60)mU•mg-1(protein)是裸质粒的20倍;实验结果也表明血清的存在不影响PLPD和Tf-PLPD的转染效率;PLPD和Tf-PLPD小于阳离子脂质体LPD对人肝癌细胞HepG2,SMMC7721和张氏正常肝细胞3种细胞株的毒性。由此可见,转铁蛋白修饰的前阳离子脂质体作为基因转运的非病毒载体具有良好的应用前景。

关键词: 转铁蛋白, 前阳离子脂质体, 制备, 转染效率

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2011年06月07日

【期刊论文】前阳离子脂质体的构建及有关性质研究

何勤, 钟志容, 邓勇, 刘戟, 张志荣, 宋庆国, 何勤*

中国药学杂志:2007,42(9)672~675,-0001,():

摘要

目的制备前阳离子脂质体并考察其相关性质。方法化学合成含二硫键的胆固醇衍生物(2.[[4-[(羟甲基)二硫]-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯,CHETA);薄膜分散-膜挤压法制备空白前阳离子脂质体;以鱼精蛋白缩合质粒DNA再与空白前阳离子脂质体作用,形成载基因前阳离子脂质体;粒度电位测定仪测定前阳离子脂质体的粒径和Zeta电位,电镜观察形态;考察在二硫键还原酶二硫苏糖醇的作用下前阳离子脂质体Zeta电位变化情况;以LacZ为报告基因转染HepG2细胞,X-gat原位染色定性观察,并定量测定β-半乳糖苷酶活性和总蛋白含量计算转染效率。结果前阳离子脂质体形态近似于球体,平均粒径为145.8nm(PDI=0.086),Zeta电位为-33.83mV,载基因前阳离子脂质体转染肝癌细胞HepG2转染效率为12.18mU•mg-1protein,是裸质粒的10.5倍。结论二硫键修饰的前阳离子脂质体是具有发展潜力的非病毒载体。

关键词: 基因治疗, 二硫键, 前阳离子脂质体, 转染效率

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2009年11月02日

【期刊论文】mdr1基因转染骨髓造血细胞移植联合超剂量化疗治疗兔VX2肝癌的实验研究

金先庆, 王佚, 王荞, 王少春, 王珊, 罗庆, 罗小辑

中华小儿外科杂志,2004,25(3):274~278,-0001,():

摘要

目的 研究mdr1基因转染骨髓造血细胞移植联合超剂量阿霉素化疗在兔VX2肝癌治疗中的骨髓保护和治疗作用。方法 通过逆转录病毒包装细胞PA317-HaMDR1/A作为载体,将mdr1基因转入兔骨髓单个核细胞并自体移植到VX2兔肝癌模型体内,在阿霉素超剂量化疗中观察骨髓造血功能的保护和肿瘤的治疗效果。结果 mdr1基因成功转入兔骨髓单个核细胞,体外4d转染率达35%;转染细胞移植后能定植于受体骨髓中并功能性表达,定植率为9.5%。在超剂量化疗中,mdr1基因能有效保护受体骨髓的造血功能,荷瘤动物耐受3倍剂量阿霉毒素化疗,外周血白细胞数能维持在(4.26±1.03)×109/L;同时超剂量化疗能迅速杀灭肿瘤细胞,使荷瘤动物存活时间明显延长(P<0.05),治愈率明显提高(P<0.05)。结论 mdr1基因转染骨髓造血细胞移植能明显提高受体骨髓对化疗药物的耐受性,联合超剂量化疗能快速、有效的杀灭肿瘤细胞,提高恶性肿瘤的治愈率。

关键词: 多药抗药基因, 转染 药物疗法, 联合

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2009年09月05日

【期刊论文】猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重组和突变克隆的转染研究

刘晓民, 徐莹, 潘尚哈, 毕丽, 李言

中华微生物学和免疫学杂志,2000,20(4):297~300,-0001,():

摘要

目的 研究猴免疫缺陷病毒(SIV)外膜糖蛋白(envGP)基因片段与病毒复制功能的关系。方法 利用两病毒株共有的内切酶位点,将非致病性SIVmac142株envGP区的DNA片段与致病性SIVmac239株的对应区域进行置换,构成多个重组体。RFLP和部分序列测序确定后,用等量突变病毒(3µg)转染CD4+T淋巴细胞CEM×174细胞系,用ELISA检测培养液中SIV核心蛋白P27水平的变化,以判定重组病毒的回复能力。结果 与SIVmac239株相比,SIVmac239 envGP重组体(SIV-mac142/239 envGP/142)仍保持高度的复制活性,SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)或SIVnac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)的复制能力明显降低,而SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)重组体无复制活性。结论 envGP基因是SIVmac239株复制能力或毒力的重要调节因素。

关键词: 猴免疫缺陷病毒, 外膜糖蛋白, 重组, 转染 病毒复制

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2009年08月07日

【期刊论文】导入TAP基因上调其在肺腺癌细胞系的表达

李殿俊, 吕雪莹, 李大林, 谷金宇, 王兰, 杨秋霞

国外医学免疫学分册,2004,27(4):242~245,-0001,():

摘要

目的 克隆TAP1及TAP2基因,分别转染TAP1及TAP2表达下调的人肺腺癌细胞系Anip973,以提高其表达水平,从而增强肿瘤细胞的抗原提呈能力。方法 采用RT-PCR方法自EBV刺激的B-LCLs克隆TAP1及TAP2基因,与pcDNA3.1/V5-His-TOPOTAExpressionvector连接,构建真核细胞表达载体,脂质体法(LipofectamineTM2000)转染人腺癌细胞系Anip973,经C418筛选4~6周,通过RI-PCR检测TAPI及TAP2的表达。结果 经测序确认已成功克隆人TAP1及TAP2基因,建立稳定表达TAP1或TAP2的细胞系,经RT-PCR分析,Anip973细胞TAPl、TAP2的mRNA表达明显增加。结论 基因转染可恢复肿瘤细胞TAP1及TAP2的表达,为增强MHCI类分子提呈肿瘤抗原奠定了基础。

关键词: 抗原处理相关转运体, 基因克隆, 转染及表达

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2009年05月12日

【期刊论文】血管内皮生长因子(VEGF)基因转染促进成骨细胞成骨活性的实验研究

裴福兴, 钟刚, 李胜富

中华创伤骨科杂志,2004,6(10):1147~1150,-0001,():

摘要

目的 了解外源性血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对成骨细胞成骨活性的影响。方法 利用阳离子脂质体Lipofectamine转染将pBLAST49-mVEGF基因导入体外培养的成骨细胞,与对照组比较,观察外源性VEGF在成骨细胞内的表达,及其对成骨细胞合成分泌骨钙素、Ⅰ型胶原的影响。结果 pBLAST49-mVEGF基因转染组第1~5代细胞合成分泌骨钙素浓度和Ⅰ型胶原的表达均明显高于对照组,二者间比较差异具有显著性(P<0.05)。结论 pBLAST49-mVEGF基因转染能促进成骨细胞生成骨钙素和合成Ⅰ型胶原的能力。

关键词: 血管内皮生长因子, 基因转染 成骨细胞, 骨钙素, Ⅰ型胶原

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2009年03月20日

【期刊论文】多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的研制及应用*

刘选明, 肖苏尧, 刘选明**, 童春义, 刘俊, 唐冬英, 赵李剑

中国科学B辑化学,2004,34(6):473~477,-0001,():

摘要

以可溶性淀粉为原料,利用反向微乳液法,加入交联剂三氯氧磷,制备了直径为50nm左右带负电荷的交联淀粉纳米颗粒。以该纳米颗粒为内核,经多聚赖氨酸修饰,得到了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNP)。对PLL-StNP进行了颗粒粒度、稳定性和电性的表征,并通过颗粒的体外细胞毒性检测、颗粒与DNA结合能力及细胞转染等方面的分析,发现多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNP)有可能作为基因载体,在此基础上发展了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的构建与基因转染技术。作为非病毒基因载体,赖氨酸淀粉纳米颗粒具有基因装载量大、转染率高、细胞毒性低以及可生物降解等优点。

关键词: 阴离子淀粉纳米颗粒 多聚赖氨酸 非病毒基因载体 基因转染

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2007年11月27日

【期刊论文】β-连环蛋白对毛囊细胞增殖的调节作用

许增禄, 仇文颖, 徐园园

解剖学报2006年12月第37卷第6期/ACTA ANATOMIA SINICA Dec., 2006, Vol. 37, No. 6,-0001,():

摘要

目的 探索β-连环蛋白促进毛囊干细胞增殖作用的分子机制。方法 利用含有氨基端删除的β-连环蛋白的表达质粒转染毛囊细胞,观察转染细胞增殖,利用Westen blotting及原位杂交法观察其目的基因c-myc的表达。结果 转染△N90β-连环蛋白基因后细胞集落形成率增加,细胞K19阳性率亦有所增加;转染细胞c-myc的表达在蛋白质水平与mRNA水平均增加。结论 β-连环蛋白对毛囊细胞增殖分化的促进作用可能是通过促进c-myc基因的表达实现的。

关键词: 毛囊, 转染 β-连环蛋白, c-myc, Western blotting,

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2009年01月19日

【期刊论文】重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

陈宝安, 朱梁军, 朱敏生, 潘英, 杜娟, 陈苏宁, 王骏, 邵泽叶

东南大学学报(医学版),2002,21(2):28~30,-0001,():

摘要

目的:构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法:用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长eDNA,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA317中,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果:经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出16个抗性克隆,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3rI3细胞测定病毒滴度为2.1×l04CFU•ml。结论:逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染。

关键词: 一氧化氮合酶, 逆转录病毒, 基因转染 聚合酶链反应

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2006年11月09日

【期刊论文】绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

田卫东, 李志勇, 刘磊, 陈希哲, 阎征斌, 林云锋

中华口腔医学杂志,2005,40(2):150~153,-0001,():

摘要

目的体外研究绿色荧光蛋白(GFP)基因转染骨髓间充质干细胞(MSCS)的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养大鼠MSCS,用重组GFP的腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒PEGFP-C1两种方法转染GFP,流式细胞术观察比较基因转染和表达结果;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组Ad-GFP对细胞的感染率达(4113±114)%,感染6周后仍有表达;脂质体组转染效率最高为1215%。病毒感染组阳性细胞与未感染组细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达均逐渐增高;诱导3周后茜素红钙盐染色均为阳性。结论重组GFP的腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCS,基因转染后细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义(P>0105),可以作为一种高效的大鼠MSCS的标记方法。

关键词: 干细胞, 荧光抗体技术, 转染 细胞分化

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2006年11月09日

【期刊论文】绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究*

田卫东, 林云锋, 敬伟, 陈希哲, 乔鞠, 李志勇, 严征斌, 吴凌, 田卫东△

四川大学学报(医学版),2006,37(5): 700~703,-0001,():

摘要

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0105);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。

关键词: 人脂肪基质细胞, 绿色荧光蛋白, 基因转染 分化

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2006年10月10日

【期刊论文】BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性

郭雄, 张银刚, 师常宏, 邹爱民, 许鹏

中南大学学报(医学版),2005,30(1)16~20,-0001,():

摘要

目的:构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法:用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS27细胞,用荧光显微镜检测和Western blotting分析其在COS27细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一步检测融合蛋白的生物活性。结果:经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/LEGFP构建成功。转染COS27细胞后,荧光显微镜和Western blotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论:基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。

关键词: BMP2, 基因转染 真核表达, 生物活性

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2006年10月10日

【期刊论文】携EGEP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

郭雄, 张银刚, 周京军, 鱼兵, 刘兵

第一军医大学学报,2005,25(1)30~36,-0001,():

摘要

目的 探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法 用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞用荧光显微镜观察转染结果:依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞。并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞。对其滴度进行测定。结果 荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论 荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。

关键词: EGFP, 重组逆转录病毒载体, 荧光激活细胞分选技术, 基因转染

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2006年05月26日

【期刊论文】重组逆转录病毒pLNCX2-GDNF转染许旺细胞及其表达

李青峰, PING Ping, LI Qing-feng, ZHANG Di-sheng

中华显微外科杂志,20003,26(2):123~126,-0001,():

摘要

目的 利用基因转染技术将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因转入许旺细胞(SC)以提高其分泌该因子的水平。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法合成GDNFcD-NA片段,以逆转录病毒pLNCX2为载体导入许旺细胞内,并运用RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA及运动神经元联合培养法检测外源性基因在mRNA和蛋白水平的表达及其产物的活性。结果:RT-PCR检测结果示GDNF-SCs表达GDNFmRNA的水平明显优于SCs;免疫细胞化学检测发现CDNF-SCs抗GDNF蛋白的水平升至正常SCs呈弱阳性;ELISA法检测结果示转染后4周CDNF-SCs分泌GD-NF蛋白的水平升至正常SCs的5.1倍;运动神经元联合培养法结果显示GDNF-SCs分泌的外源生基因产物具有生物学活性。结论 GDNF基因转染SC在mRNA和蛋白水平表达GDNF明显优于正常SCs,外源性基因表达产物具有神经生物学活性。

关键词: 许旺细胞, 胶质细胞源性神经营养因子, 基因转染 逆转录病毒

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2006年04月19日

【期刊论文】重组腺相关病毒转染神经干细胞球的实验研究*

王任直, DOU Wan-chen, WANG Ren-zhi, LI Gui-lin, WANG Xin, LI Xue-kun, ZHAN GBo, TIAN Shi-qiang, YAO Yong

中国应用生理学杂志,2004,20(2):166~170,-0001,():

摘要

目的:探讨重组腺相关病毒2型(rAAV2)对神经干细胞球的转染能力。方法:①将FITC标记的rAAV(FITC2rAAV2)分成两组,A组直接与神经干细胞球混合,B组与肝素混匀后再与神经干细胞球混合,孵育30min后在荧光显微镜下观察;②含有GFP报告基因的rAAV2(rAAV2-GFP)与神经干细胞球孵育30min后,分成两组:A组继续在培养箱内培养,B组分散成单细胞后移植到大鼠脑内,一个月后分别在荧光显微镜下观察神经干细胞球和大鼠脑组织切片中报告基因的表达情况;③将含有低氧启动子(低氧应答元件,HRE)、VEGF和GFP的rAAV2(rAAV2-HRE-VEGF-GFP)转染神经干细胞球后分为两组:A组在低氧条件下培养,B组在常规条件下培养,72h后观察报告基因的表达情况。结果:①FITC-rAAV2转染神经干细胞球的结果:A组有明亮的绿色荧光,B组基本无绿色荧光;②rAAV2-GFP转染神经干细胞球后一个月,A、B两组均可以看到绿色荧光;③rAAV2-HRE-VEGF-GFP转染神经干细胞球后72h,A组可见绿色荧光,B组无绿色荧光。结论:rAAV2可以与神经干细胞球特异性结合,rAAV2携带的外源基因在体内和体外均可以有效表达,rAAV2携带外源基因的表达可以人为调控。

关键词: rAAV2, 转染 神经干细胞球

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2006年07月27日

【期刊论文】以GFP为标记的肝癌细胞RNA转染树突状细胞的体外效应

任军, 张利旺, 张红梅, 刘文超, 潘伯荣, 斯晓明

第四军医大学学报,2006,27(11):1046-1048,-0001,():

摘要

目的:探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性。方法:绿色荧光蛋白质粒载体pGFP2C3稳定转染肝癌细胞HepG2,Trizol法提取筛选后细胞HepG2-GFP总RNA;分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞,总RNA转染DCs,荧光显微镜下观察转染效果,流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化; EL ISA法检测转染前后上清中IL212变化情况;MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。结果:pGFP2C3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2-GFP,荧光显微镜下呈绿色荧光;总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光,CD80(13.2%上升至86.7%),HLA2DR(38.9%上升至97.9%),CD83(0.9%上升至97.1%),CD86(31.2%上升至92.5%)表达明显升高,上清IL212分泌量ng/L显著增高(61.3±8.1→287.4±29.3,P<0.05);诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用。结论:GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记,肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗。

关键词: 树突状细胞, 绿色荧光蛋白, RNA, 转染

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2006年07月27日

【期刊论文】AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫

任军, 贾军, 张利旺, 张红梅, 郭晓彤, 斯晓明, 王九花, 程婕

第四军医大学学报,2005,26(8):755-757,-0001,():

摘要

目的:以AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的树突状细胞(DC),诱导DC产生特异性抗肝癌免疫,观察其对肝癌细胞的杀伤。方法:采用化疗和集落刺激因子动员肝癌患者外周血造血干细胞,血细胞分离机采集CD34+造血干细胞,IL24、GM2CSF联合TNF2α刺激CD34+细胞分化为DC。通过脂质体转染的方法将携带人AFP基因质粒pEGFP-AFP转染树突状细胞,MTT法检测对人肝癌细胞HepG2的特异性杀伤。结果:经细胞因子刺激诱导培养的DC具有典型的分枝状突起,高表达CD11C,CD80,CD86。转染AFP基因后可见到转染细胞表达绿色荧光蛋白,细胞化学染色胞质内可见到红色颗粒。MTT法检测AFP基因转染后的DC可诱发特异性CTL反应杀伤HepG-细胞,AFP基因转染组、空载体组和对照组的杀伤率分别为(92.0±3.5)%,(75.5±4.1)%和(72.9±3.4)%,转染组与空载体组和对照组间存在显著性差异(P<0.05)。结论:AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的DC可诱导特异性CTL反应杀伤肝癌细胞。

关键词: 甲胎蛋白类, 转染 树突细胞, 肝肿瘤

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2005年11月16日

【期刊论文】过氧化物酶体增殖物活化受体γ减少高糖诱导系膜细胞外基质的积聚及其机制

马骥, SUN Jing, MA Ji, GU Yong, LIN Shan-yan.

中华肾脏病杂志,2004,20(4):255~259,-0001,():

摘要

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)γ对高糖诱导肾小球系膜细胞(GMc)外基质(ECM)积聚的抑制作用及其机制。方法以表达野生型小鼠PPAγl的质粒pIREs2-EGFP-mPPARγl/WT转染系膜细胞(wT),然后予30mmol/L的高糖(HG)刺激48h,以EusA法检测细胞上清液中TGFβ1、纤连蛋白(FN)的浓度。GMc中c-fos、c-jun、葡萄糖转运蛋白l(GLuT-1)mRNA的表达检测采用半定量RT-PcR法,并以weslem印迹检测胞浆中核因子抑制物(I-KB)、核因子(NF-KB)及胞核中NF-KB、磷酸化细胞外调节激酶(p-ERK)的蛋白表达水平。同时以2umol/L的PPARγ激活剂吡咯列酮(Pi0)、转染表达功能缺陷的突变型(dominant negative,DN)PPARγ1的质粒pIREs2-EGFP.mPPARγl/DN(DN)或空白质粒pIREs2-EGFP作为对照。PPARγ的活性以其与PPARγ反应元件(PPRE)的结合能力表示。结果HG培养时系膜细胞的PPARγ活性较正常糖浓度(5mmol/L)培养时明显上升(P<0.01),HG+wT组的PPAγ活性显著高于HG+DN、HG-pIREs2-EGFP和HG+Pio组。与HG+DN、HG+pIREs2.EGFP相比,wT转染所致的PPARγl高表达能显著抑制高糖诱导GMc的TGFB-1、FN生成增多,减轻c-fos和c-jun的mRNA表达的上调,改善p-ERK蛋白水平的增加、胞浆I-kB表达的降低以及NF-KB由胞浆向胞核转移的增加(P均<O.05)。wT对HG时高表达的GLuT-1mRNA无显著影响。Pio除对P-ERK蛋白水平、NF-KB胞核/浆比例具有显著性改善作用外,对上述其他指标无明显作用。结论PPARγl过表达能抑制由高糖诱导的GMc EcM的增多,其机制可能是通过抑制了ERK/激活蛋白(AP)1及NF-KB等信号分子的传递。提示在糖尿病状态下,增高PPARγ活性可能具有直接的抗纤维化效应。

关键词: 过氧化物酶体激增剂, 转染 信号通道, 系膜细胞

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