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2009年10月21日

【期刊论文】豌豆来源的毒性抗虫白蛋白cDNA在毕赤酵母中异源表达及抗虫毒性分析

周天鸿, 李弘剑), 张毅), 周天鸿)*

中国生物化学与分子生物学报,2004,20 (1): 44~49,-0001,():

摘要

一种来源于豌豆的白蛋白(PA)对多种昆虫具有明显的毒性作用,为了进一步研究其抗虫机理,采用基因工程的方法富集蛋白质.将该白蛋白基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA.并导入毕赤酵母茵CS115中表达,通过PCR和Northem印迹法分析基因的整合及转录,对工程茵进行发酵,采用两步培养:第一步富集菌体,第二步甲醇诱导工程菌表达重组蛋白,并分泌到培养基中.经过超滤和HPLC分离,重组抗虫白蛋白得率约10 mg/L.重组蛋白对象鼻虫敏感株表现出很强的毒力,半致死剂量LC50为4.7,与直接纯化于豌豆种子的白蛋白毒力一致,而对象鼻虫抗性株无明显毒力.

关键词: 杀虫剂,, 豌豆白蛋白,, 异源表达,, 毕赤酵母,, 象鼻虫

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2009年01月19日

【期刊论文】生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建*

李华钟, 李寅, 林金萍, 陈坚**

微生物学报,2001,41(2):191~197,-0001,():

摘要

利用重组大肠杆菌Ⅱ21中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH2J7中的ATP生物合成酶系,构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加1mmol/LAMP和0105mmol/LNADH,即可启动酵母的酵解途径。提高耦合系统中的葡萄糖浓度,可促进GSH的合成。当葡萄糖浓度为400mmol/L时,系统内GSH浓度达到1014mmol/L(312g/L)。Mg2+缺乏时,耦合系统和外加ATP的非耦合系统均不能合成谷胱甘肽。耦合系统中Mg2+与ATP 形成螯合物,可能是导致耦合系统中GSH产量较低的原因。在耦合系统中补加Mg2+,反应6h时GSH浓度达到1413mmol/L(414g/L)。

关键词: 重组大肠杆菌,, 面包酵母,, 种间耦合ATP再生系统,, 谷胱甘肽,, 生物合成,, 构建

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2009年01月19日

【期刊论文】氧化磷酸化抑制剂对光滑球拟酵母糖酵解速度的影响*

李华钟, 刘立明, 陈坚, 李寅

生物化学与生物物理进展,2005,32(3):251~257,-0001,():

摘要

研究了不同浓度电子传递链抑制剂(鱼藤酮和抗霉索A)和F. F. ATPase抑制剂(寡霉索)对光滑球拟酵母胞内ATP水平、葡萄糖消耗速度、糖酵解途径关键酶的影响在培养液中添加10m;儿鱼藤酮和抗霉索A,相对于对照组,胞内ATP分别下降了43%和27.7%,使糖酵解关键酶磷酸果糖激酶fPFK)的活性分别提高340%和230%,从而导致葡萄糖消耗速度增加360%和240%,丙酮酸生成速度提高了17%和8.5%改变胞内ATP水平并不影响糖酵解途径其他关键酶HK、PK活性微量的寡霉索(0.05mg/L)可使胞内ATP含量下降64.3%,当培养液中寡霉索浓度达到0.4mg/L时,细胞不能继续生长,葡萄糖消耗速度和丙酮酸的生成速度却随着寡霉索浓度(小于06mg/L1的增加而增加表明氧化磷酸化途径中,ATPase决定着ATP的生成降低胞内ATP含量能显著提高PFK活性(γ2=0.9971),葡萄糖消耗速度(γ2=0.9967)以及丙酮酸生产速度(γ2=0.965),葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶PFK活性(γ2=01958)和PK活性(γ2=0.8706)增加所导致的这一结果有利于揭示真核微生物细胞中氧化磷酸化与中心代谢途径(酵解)的关系。

关键词: 光滑球拟酵母,, 氧化磷酸化抑制剂,, 酵解,, ATP

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2006年06月01日

【期刊论文】人纤溶蛋白酶原K5在毕赤酵母中的表达及其生物活性鉴定

吕红, SHEN Li, SONG Da-Xin, GAO Bo-Yu, L

生物工程学报,2004,20(6):879~883,-0001,():

摘要

化学合成人纤溶蛋白酶原K5(pK5)的编码基因并克隆到毕赤氏酵母表达系统的分泌型载体pPIC9K上,将重组质粒经BglⅡ单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,筛选出对G418有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导后,用15%SDS-PAGE检测发酵上清液,表明有重组蛋白pK5的高表达。经CM.Sepherose离子交换柱和Superdex 75分子筛层析两步分离纯化,获得了纯度达到98%的rpK5。用MTT方法检测的结果表明,纯化的rpK5可显著地抑制人血管内皮细胞的生长。

关键词: 人纤溶蛋白酶原K5,, 酵母,, 分泌表达,, 内皮细胞增殖分析

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2004年12月28日

【期刊论文】转译起始密码子周边序列的改变对Δ6-脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

邢来君, 张琦, 李明春, 孙颖, 马海庭, *

微生物学报,2004,44,(4):536~539,-0001,():

摘要

将少根根霉中Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)的起始密码子周边序列作适当的修改,并把修改后获得的片段(RAD6-1)亚克隆到表达载体pYES2.0,构建重组表达载体pYRAD6-1。经测序验证,把pYRAD6-1 转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达分析,同时以空载体pYES2.0和出发序列所构建的pYRAD6作为对照。通过气相色谱(GC)和气相色谱P质谱(GC-MS)分析表明,在pYRAD6和pYRAD6-1转化的酿酒酵母中生成γ-亚麻酸,而pYES210中没有检测到。其中,pYRAD6-1转化的酿酒酵母γ-亚麻酸表达量占细胞总脂肪酸含量的5.23%,而对照pYRAD6转化的酿酒酵母中表达量只占2.64%。

关键词: 少根根霉,, Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,, 转译起始密码子,, 酿酒酵母,, γ-亚麻酸,, 表达

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2005年07月18日

【期刊论文】氧化磷酸化抑制剂对光滑球拟酵母糖酵解速度的影响*

陈坚, 刘立明, ), 李华钟, 李寅, )**

,-0001,():

摘要

研究了不同浓度电子传递链抑制剂(鱼藤酮和抗霉素A)和F0F1-ATPase抑制剂(寡霉素)对光滑球拟酵母胞内ATP水平、葡萄糖消耗速度、糖酵解途径关键酶的影响在培养液中添加10m/L儿鱼藤酮和抗霉素A,相对于对照组,胞内ATP分别下降了43%和27.7%,使糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFK)的活性分别提高340%和230%,从而导致葡萄糖消耗速度增加360%和240%,丙酮酸生成速度提高了17%和8.5%改变胞内ATP水平并不影响糖酵解途径其他关键酶HK、PK活性微量的寡霉素(0.05mg/L)可使胞内ATP含量下降64.3%,当培养液中寡霉素浓度达到0.4mg/L时,细胞不能继续生长,葡萄糖消耗速度和丙酮酸的生成速度却随着寡霉素浓度(小于0.6mg/L)的增加而增加表明氧化磷酸化途径中,ATPase决定着ATP的生成。降低胞内ATP含量能显著提高PFK活性(r2=0.9971),葡萄糖消耗速度(r2=0.9967)以及丙酮酸生产速度(r2=0.965),葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶PFK活性(r2=0.9958)和PK活性(r2=0.8706)增加所导致的这一结果有利于揭示真核微生物细胞中氧化磷酸化与中心代谢途径(酵解)的关系。

关键词: 光滑球拟酵母,, 氧化磷酸化抑制剂,, 酵解,, ATP

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2006年11月07日

【期刊论文】瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的分离与鉴定

汪天虹, Merja Penttil, 高培基, 王春卉, 钟玲

生物工程学报,1998,14(3):320~325,-0001,():

摘要

将在木聚糖上生长的瑞氏木霉(Trichodermareesei)RutC230的cDNA文库全部质粒转化已携带有毕赤氏酵母(Pichiastipitis)木糖还原酶基因的重组酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株H475,在H475中构建了瑞氏木霉的CDNA表达亚文库。在以木糖为唯一碳源的选择性酵母合成培养基上,从该亚文库中筛选到瑞氏木霉木糖醇脱氢酶CDNA基因,该基因片段长为113kbSouthern、Northern印迹杂交分析和蛋白质凝胶电泳结果表明该基因确实来源于瑞氏木霉,所编码蛋白质分子量约为40kDa,携带有毕赤氏酵母木糖还原酶和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酵母能够在以木糖为唯一碳源的培养基上生长,并能将90%以上的木糖转化为木糖醇、乙醇和其它副产品。

关键词: 瑞氏木霉,, 木糖醇脱氢酶基因,, 酿酒酵母,, 木糖

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2005年01月28日

【期刊论文】D2氨基酸氧化酶在不同毕赤酵母宿主菌中的表达比较

周珮, 冯美卿, 黄海, 史训龙, 余志良, 袁中一*, 周珮*

生物工程学报,2004,20(4):572~577,-0001,():

摘要

D2氨基酸氧化酶(DAAO)在转化头孢菌素C生产72ACA和转化DL2氨基酸制备α-酮酸和L-氨基酸上起着重要的作用。采用DNA操作技术,将来源于三角酵母的DAAO基因连接至表达载体pPIC3·5K上,再将表达质粒pPIC3·5K-DAAO分别整合P. pastoris的宿主细胞KM71和GS115,经筛选获得阳性重组菌PDK13(MutS)和PD27(Mut+)。重点对两种突变菌的表达条件进行了比较。结果显示:PDK13(MutS)株比PD27(Mut+)株消耗甲醇慢、诱导时间长,但对通气量要求低、表达水平高,摇瓶活力分别达到2700和2500IUPL,14L发酵罐内活力分别达到10140和8463IUPL。初步探索了DAAO对DL2苯丙氨酸的拆分,结果显示基因工程菌表达的DAAO 具有良好的转化DL2苯丙氨酸制备苯丙酮酸和L2苯丙氨酸的能力。

关键词: D2氨基酸氧化酶,, 甲醇酵母,, 不同宿主菌,, 表达比较,, DL2苯丙氨酸,, 拆分

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