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2010年12月08日

【期刊论文】乙型肝炎病毒聚合酶在重组腺病毒系统中的表达

钟江

,-0001,():

摘要

乙型肝炎是一个世蚧范围的传染病,在我国为害尤其严重。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)作为引起人类急性、慢性肝炎的主要病原体之一,属嗜肝DNA病毒科。虽然其基因组仅有3.2kb,但基复制和致病机理过程复杂,突变众多,目前还没有根治的方法。因此,发展抗乙肝药物的研究显得尤为必要。乙肝病毒聚合酶(HBV polymerase)是病毒复制的关键酶,具有TP(蛋白引物)、间隔区(删除大部分后不影响功能)、RT(逆转录酶)、RnaseH等多个功能区域,是抗乙肝药物作用的理想位点。乙肝聚合酶很难在感染细胞中分离纯化,也一直很难在哺乳动物细胞中大量重组表达,严重阻碍了抗乙肝药物和乙肝疫苗的研究。本研究选取高复制型的临床分离株HBV-56,克隆拼接了全长的多聚酶基因,并将基插入穿梭质粒,通过重组穿梭质粒在细菌细胞内与带有腺病毒基因组的质粒发生同源重组,得到带有HBV多聚酶的重组腺病毒质粒。该质粒线性化后转染人胚肾细胞转化细胞系293,成功地得了重组病毒。用该重组病毒感染293细胞系,SDS-PAGE检测,发现了新的蛋白的合成,该蛋白质的分子量与文献报道的乙肝聚合酶的分子量一致,用PCR的方法,初步证明了所表达的乙肝聚合酶具有逆转录酶的活性,合成了对应于HBV聚合酶基因的DNA分子。这一结果将促进对于抗乙肝药物研究和对乙肝病毒复制机制的认识。

关键词: 乙型肝炎病毒聚合酶, 重组腺病毒, 半定量PCR, 逆转录酶

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2009年11月03日

【期刊论文】RNA干扰介导对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

黄爱龙, 唐霓①, 张秉强①, 闰歌①, 蒲丹①, 高小玲①, Tong-Chuan He②, 黄爱龙①*

科学通报,2004,49(12):1145~1150,-0001,():

摘要

构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区或表面抗原编码区的siRNA表达载体pSI-C和pSI-S,在体外HBV复制细胞模型中观察对HBV复制和表达的影响。将pSI-C,pSI-S与1.3倍HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞,分别在转染后24,48和72 h,观察pSI-C和pSI-S对细胞上清和胞内病毒抗原表达的影响,并用分子杂交方法从病毒复制、转录和翻译水平检测目的基因的表达情况,实验结果表明,pSI-C及pSI-S能明显抑制细胞内HBsAg和HBcAg的合成,呈序列特异性和剂量依赖性的特点,而对照组siRNA无抑制作用。pSI-C比pSI-S抑制作用更强,转染后第2天对HBsAg和HBeAg押制率达高峰,分别为92%和85%。Southern和Northern杂交结果表明,HBV siRNA能降低目的基因转录和病毒复制中间体的表达水平,提示针对乙型肝炎病毒核心区和表面抗原编码区的siRNA能有效抑制HBVRNA分子转录和病毒复制,最终降低病毒抗原表达,这为运用RNAi技术进行HBV基因治疗提供了新的思路。

关键词: 抗病毒治疗 乙型肝炎病毒 RNA干扰 病毒复制 基因治疗

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2009年11月01日

【期刊论文】乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变基在人肝癌细胞的表达

任红, T. Harrison A. J. Zuckerman

中华医学杂志,1995,75(7):396~398,-0001,():

摘要

为了进一步研究乙型肝炎病毒(HBV)的s基因变异在免疫逃逸中的作用,我们通过酶消化质粒载体pEcob(含双拷贝HBVDNA),得到约900bp的HBV-s基因片断。将其插入到噬菌载体pBluescriptSK+的 Smal位点上。然后通过体外寡棱苷酸介导的人工定点突变获得一系列(共种)s基 因“免疫逃逸”突变型。再通过 EB病毒真棱表达载体pMEP4将s基因突变型片断定向克隆pMEP4上,从而构建了含HBVs基因突变型的重组质粒pMEP4HBSM。用其转染人肝癌传代细系HepG2,经潮霉素选择,3周后获得抗性细胞克隆经用HBV-s单克隆抗体检测发现除含变异145(gp145位上甘氨酸为精氨酸替代)外,其余变异体HBsAg均为阳性。经 Western blot杂交证实异体145在分子量约为24000处也存有一特异性HBsAg蛋白带。这一表达细胞系的成功建立HBV免疫逃逸的诊断和治疗提供了基础。

关键词: 乙型肝炎 乙型肝炎病毒 基因突变

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2009年10月30日

【期刊论文】HBsAg HBeAg 作用 PBLs 对 TCR Vβ基因表达的影响*

黄树林, 陈红清, 李菁华, 李依娜, 罗利琼

世界华人消化杂志,1999,7(1):25~27,-0001,():

摘要

目的 探讨乙肝病毒(HBV)与肝癌的相关性。方法 取用乙肝疫苗注射3次前后外周血淋巴细胞(PBL):HBV DNA转染的HepG2 2215株培养上清(HBsAg,HBeAg阳性)感染健康人PBL后进行TCR Bβ基因1-20亚家族表达水平的分析。结果 乙肝疫苗注射后及HepG2 2215株培养上清感染健康人PBL后TCR Vβ6、14,Vβ6.15特异性扩增而表达水平显著增高。结论 vβ6可能为识别HBV抗原或引发免疫应苔的基因片段,但Vβ14,15各自在限制和杀伤功能方面起着重要的作用,这从分子水平上又证明了HBV与肝癌的关系。

关键词: 乙型肝炎病毒 肝肿瘤, 乙型肝炎表面抗原, 乙型肝炎e抗原, TCR Vβ基因, 基因表达

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2009年03月30日

【期刊论文】IFN-γ基因对表达DHBVpreS/S蛋白质的DNA疫苗诱生免疫应答的影响

瞿涤, 龙健儿, 黄莉娜, 秦智强, 王文逸

中华微生物学和免疫学杂志,2003,7(7):529-533,-0001,():

摘要

目的 利用DHBV感染鸭模型,研究鸭IFN-γ真核表达质粒作为免疫佐剂对DNA疫苗诱导免疫应答的影响和预防DHBV感染的作用。方法 用DuIFN-γ真核表达质粒与DHBpreS/SDNA疫苗共免疫,或用DHBpreS/SDNA疫苗单独免疫正常幼鸭,检测经免疫前后鸭PBMC表达DuIFN-γ的mRNA水平(半定量竞争性RT-PCR)、诱生的抗体水平(ELISA)、病毒攻击免疫鸭后血清和肝脏中的病毒DNA变化(斑点和Southern印迹核酸杂交)。结果 IFN-γ表达质粒作为免疫佐剂,可以增强DNA疫苗诱导的鸭PBMCIFN-γ的mRNA表达水平。用大剂量病毒攻击免疫鸭的结果显示,用DuIFN-γ表达质粒和DHBpreS/SDNA疫苗共免疫鸭清除DHBV的速度,明显比仅用DHBpreS/SDNA疫苗免疫鸭清除病毒的速度快,肝脏中DHBV总DNA和共价闭环DNA(cccDNA)的量也低于DHBpreS/SDNA单独免疫组。结论 IFN-γ真核表达质粒作为免疫调节佐剂在DNA免疫中具有潜在的应用价值。

关键词: 鸭IFN-γ, 竞争性RT-PCR, 乙型肝炎病毒 DNA免疫

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2009年03月30日

【期刊论文】复方药物ZL-1在鸭乙型肝炎病毒实验感染模型中抗病毒作用的研究

瞿涤, 牛巍, 张继明, 王文逸, 龙健儿, 曾毅, 李泽琳

上海医学,2003(4):234-238,-0001,():

摘要

目的 研究中药复方ZL-1在鸭己型肝炎病毒(DHBV)持续性感染模型中抗嗜肝DNA病毒的作用。方法 应用中药复方ZL-1治疗实验感染鸭,口服给药,剂量500mg•kg-1•d-1,分2次服用,连续4周。采用斑点分子杂交和southem印迹杂交检测治疗后感染鸭血清和肝脏中病毒的动态变化。同时以拉米夫定及安慰剂作为对照组。结果 复方药物ZL-l治疗后血清中DHBvDNA均数从3.6×1010拷贝/ml下降至0.9×1010拷贝/ml(P<001),抑制病毒率为75%,但尚不能清除病毒血症,肝组织中总DHBvDNA和DHmv超螺旋型DNA量无明显减少,停药观察2周,病毒复制反弹不明显。拉米夫定治疗后可显著降低病毒血症(P<0.01),抑制病毒率达99%,同时肝组织中总DHBVDNA和DHBV超螺旋型DNA量减少,但停药观察2周,病毒复制反弹明显。安慰剂组(口服生理盐水)治疗前后病毒水平的差异无显著性(P>0.05)。结论 复方药物ZL-1治疗4周可使感染鸭病毒血症降低。但不能清除病毒血症,肝脏中病毒复制水平也无显著下降。

关键词: 抗病毒治疗, 乙型肝炎病毒感染

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2009年03月18日

【期刊论文】抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选

马春红, 孙汶生, 刘素侠, 丁培芳, 张利宁, 曹英林, 宋静

中华微生物学和免疫学杂志,2000,20(1):012~014,-0001,():

摘要

目的 寻找抗HBV 最佳反义寡核苷酸区段。方法 合成4种互补于HBV不同区段的反义硫代寡核苷酸(asON),加入HBV基因转染的肝癌细胞模型HepG22.2.15,以ELISA法测定HBsAg、HBeAg含量。结果 互补于pre2S2翻译起始区的asON(序列Ⅰ)抗HBV基因表达作用最强(P<0.02),对HBsAg、HBeAg的最高表达抑制率分别为66%和91%,针对增强子Ⅱ(ENⅡ)的序列Ⅲ也有较强的抑制作用(52%、56%)。asON抗HBV作用具有明显时相性,其抑制作用随时间延长而有反跳,且针对增强子Ⅱ的反义序列Ⅲ和针对S基因起始区的反义序列Ⅱ的抑制作用规律相似,并在时相上与序列Ⅰ互补。结论 4种asON中,序列Ⅰ抗HBV基因表达作用最强,而且序列Ⅰ与Ⅲ或Ⅱ配伍有望成为理想的抗HBV基因药物。

关键词: 乙型肝炎病毒 反义寡核苷酸, 基因表达

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2009年03月18日

【期刊论文】反义寡核苷酸抗HBV作用的双峰现象

马春红, 孙汶生, 张利宁, 曹英林, 宋静, 刘素侠, 丁培芳

世界华人消化杂志,1999,7(8):708-709,-0001,():

摘要

HBV基因组含3.2kbDNA,有至少4个ORF,其中S区包含S基因,pre-S1基因和pre-S2基因,编码形成大、中、小3种蛋白,构成HBV的包膜蛋白(HBsAg, preS1Ag, preS2Ag)。其中HBsAg在体内引起的免疫病理反应是HBV感染中的重要致病机制,preS2Ag较HBsAg有更强的抗原性,并具有反式激活作用,在HBV感染及肝癌发生中关系密切。因而如何从基因水平抑制HBsAg和preS2Ag的表达,对抗HBV治疗有重要意义。我们设计了针对S基因翻译起始区和preS2基因翻译起始区的反义寡核苷酸(asON)作为基因封条,作用于HepG2.2215细胞,对其抑制作用进行研究,并首次报道了asON抑制作用的双峰现象,为开发新型抗HBV基因药物奠定基础

关键词: 乙型肝炎病毒 寡核苷酸类,, 反义, 乙型肝炎表面抗原, 乙型肝炎核心抗原

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2005年07月14日

【期刊论文】新型铕络合物用于HBsAg的时间分辨荧光免疫检测

李庆阁, 朱艳冰, 王桂兰, 袁景利

标记免疫分析与临床,2002,9(3):157~160,-0001,():

摘要

利用稳定的新型铕荧光络合物BHHCT与Eu3+标记羊抗人HBsAb和Eu3+标记BSA-SA,建立定量测定血清HBsAb的Eu3+ -BHHCT-HBsAb-TRFIA法和Eu3+ -BHHCT-BSA-SA-TRFIA法。结果表明,这两种方法最低检出值分别为0.2ng/mL和0.05ng/mL,标准曲线范围均为0-100ng/mL,批内变异系数CV均小于10%后者回收率为85%-115%用Eu3+ -BHHCT-BSA-SA-TRFIA法与ELISA法同时检测118份血清样品,结果表明前者的检出率比后者高。

关键词: 铕荧光络合物, 时间分辨荧光免疫分析法, 乙型肝炎病毒表面抗原, 定量测定

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2004年12月31日

【期刊论文】乙型肝炎及慢性丙型肝炎患者混合感染庚型肝炎病毒的致病性研究*

朱万孚, 黄健, *, 李倬, 孙静媛, 郝娃, 王笑梅, 李朋, 庄辉

自然科学進展,2002, 12(3)307~310,-0001,():

摘要

为探讨庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)感染有无致病性,利用GBV-C/HGV不同基因区序列设计并优选出5套引物,建立起灵敏、特异的HGV逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测方法。应用此方法对临床上诊断为乙型肝炎及慢性丙型肝炎的患者,按照其血清中HGV RNA的阳性与否分组,并进行病例对照研究。结果显示,单独HBV或HCV感染的肝炎患者与混合HGV感染的肝炎患者的血清肝功能异常指标无显著性差异(P>0.05)。因此,病毒性肝炎患者混合感染HGV后,未发现加重HBV或HCV感染的肝功能异常程度,不支持HGV有明显的嗜肝致病性。

关键词: 庚型肝炎病毒, 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒致病性研究

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