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2009年11月03日

【期刊论文】RNA干扰介导对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

黄爱龙, 唐霓①, 张秉强①, 闰歌①, 蒲丹①, 高小玲①, Tong-Chuan He②, 黄爱龙①*

科学通报,2004,49(12):1145~1150,-0001,():

摘要

构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区或表面抗原编码区的siRNA表达载体pSI-C和pSI-S,在体外HBV复制细胞模型中观察对HBV复制和表达的影响。将pSI-C,pSI-S与1.3倍HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞,分别在转染后24,48和72 h,观察pSI-C和pSI-S对细胞上清和胞内病毒抗原表达的影响,并用分子杂交方法从病毒复制、转录和翻译水平检测目的基因的表达情况,实验结果表明,pSI-C及pSI-S能明显抑制细胞内HBsAg和HBcAg的合成,呈序列特异性和剂量依赖性的特点,而对照组siRNA无抑制作用。pSI-C比pSI-S抑制作用更强,转染后第2天对HBsAg和HBeAg押制率达高峰,分别为92%和85%。Southern和Northern杂交结果表明,HBV siRNA能降低目的基因转录和病毒复制中间体的表达水平,提示针对乙型肝炎病毒核心区和表面抗原编码区的siRNA能有效抑制HBVRNA分子转录和病毒复制,最终降低病毒抗原表达,这为运用RNAi技术进行HBV基因治疗提供了新的思路。

关键词: 抗病毒治疗 乙型肝炎病毒 RNA干扰 病毒复制 基因治疗

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2009年11月03日

【期刊论文】RNA干扰技术对肝癌细胞内源survlvln基因表达的影响*

黄爱龙, 闫歌), 蒲丹), 唐霓), 高小玲), 宋文鑫), 卢年芳), 吴刚), TONG-CHUAN HE)黄爱龙)**

生物化学与生物物理进展,2004,31(9):829~832,-0001,():

摘要

应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对凋亡抑制因子survlvln的siRNA抑制肝癌细胞株内源survlvln基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin至肝癌细胞株SMMC-7721,通过免疫荧光、蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survlvln蛋白表达及mRNA转录水平的变化。结果表明:构建的三种重组质粒pshRNA-survivinl/2/3均能明显抑制survlvln基因的表达;应用免疫荧光检测survlvln基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin的实验组survlvln荧光强度明显低于转染载体pTZU6+1和pshRNA-GFP对照组;蛋白质印迹结果表明,重组质粒pshRNA-survivin明显抑制survlvln蛋白韵表达,抑制率为62%~78%,通过半定量RT-PCR检测到su rvivln基因mRNA转录明显减少,抑制率为57%~64%。由上述结果可以得出结论:重组质粒pshRNAsurvivlri可明显抑制SMMC-7721细胞内源survivin的表达和mRNA的转录,为survlvln介导的肿瘤基因沉寂疗法提供实验基础。

关键词: RNA干扰,, 肝癌细胞株,, survIvin基因

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2009年11月03日

【期刊论文】shRNA表达载体构建方法的优化

黄爱龙, 张秉强, 唐霓, 黄爱龙*, 闫歌, 陶鹏, Tong-Chuan He, 张君

生物技术通报,2004,6:47~49,-0001,():

摘要

目的探讨shRNA表达栽体的构建方法,以加速RNA干扰研究的进程。方法对shRNA表达裁体的构建过程进行分析和监测,并加以优化。结果发现shRNA表达栽体构建的退火过程容易产生障碍,经优化退火缓冲液的NaCl含量后,能明显提高退火效率及shRNA表达载体构建的成功率。结论shRNA表达载体构建的退火过程需加以关注,退火缓冲液中NaCi含量应提高至200mmol/L以上为宜。

关键词: RNA干扰 夹状RNA(, shRNA), 退火方法

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2009年11月03日

【期刊论文】应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

黄爱龙, 吴莹, 唐霓, 张秉强, 卢年芳

中华医学杂志,2005,85(9):630~634,-0001,():

摘要

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBVl.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI-C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT-PCR检测肝组织HBV C区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBVl.3感染组中高表达(A值为4.08~9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%~10%:pSI-C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04~1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT-PCR示肝内HBV C mRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI-C mut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。

关键词: 肝炎病毒,, 乙型, 模型,, 动物, 基因疗法, RNA干扰

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2009年11月01日

【期刊论文】胚胎细胞MAD2基因表达对染色体分离的影响

翁亚光, 施琼, 蔡燕, 刘青松, 刘子杰

ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE 27 15(2005)1544-1547,-0001,():

摘要

目的 探讨MAD2基因表达对染色体分离的影响。方法 用定量RT2PCR比较RNA干扰前后的胚胎细胞内源性基因MAD2 mRNA表达水平,同时对染色体数目异常率进行比较分析。结果 干扰后MAD2基因mRNA拷贝数/GAPDH基因mRNA拷贝数的均值为干扰前的20%,染色体数目异常率均值由干扰前的4.702%上升到28.498%.经统计学分析,RNA干扰后MAD2基因mRNA水平显著下降,染色体数目异常率显著增高.结论 MAD2基因表达的降低会导致染色体分离的异常,本研究为染色体分离相关蛋白功能研究建立了新的研究手段和实验评价体系。

关键词: MAD2基因, RNA干扰 定量RT2PCR

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2009年11月01日

【期刊论文】RNA干扰抑制BUBI基因表达对染色体分离的影响

翁亚光, 施琼, 王箭, 朱旦, 翁亚光l, △, 王应雄, 蔡燕, 刘青松, 刘子杰

CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.29 No.1(2006)35-39,-0001,():

摘要

目的:研究BUBI基因表达调控对染色体分离的影响。方法:用定量RT-PCR比较RNA干扰前后的胚胎细胞内源性基因BUB1的mRNA水平,同时对染色体数目异常率进行比较分析。结果:干扰后BUBI基因mRNA拷贝数/GAPDH基因mRNA拷贝数的均值为干扰前的21.80%,染色体数目异常率均值由干扰前5.02%上升到29.61%。经统计分析,RNA干扰前后BUBI基因mRNA水平和染色体数目异常率有显著差异。结论:BUBI基因表达的降低会导致染色体分离的异常,本研究为染色体分离相关蛋白功能研究建立了新的研究手段和实验评价体系。

关键词: BUBI基因, RNA干扰 定量RT-PCR, 胚胎细胞

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2009年10月24日

【期刊论文】CXCR4短发夹shRNA表达质粒的构建

李少林, 杜铭, 李静

重庆医学,2005,34(6):892~896,-0001,():

摘要

目的 构建趋化因子受体CXCR4shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列。经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2. 1-U6 neo质粒栽体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。结果 成功构建了CXCR4hRNA质粒重组体。结论 CXCR4 shRNA质粒重组体的成功构建为研究CXCR4靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础。

关键词: CXCR4, RNA干扰 重组体, 序列分析

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2009年05月12日

【期刊论文】bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定*

刘霆, 席亚明, 刘霆Δ, 孟文彤, 汪宇辉, 顾玲, 陆晓茜, 龚玉萍

四川大学学报(医学版),2005,36(4):460~463,-0001,():

摘要

目的 构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterfering RNA, siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs, shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。

关键词: 慢性髓细胞性白血病bcr/, abl融合基因真核表达载体RNA干扰K562

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2009年05月12日

【期刊论文】抗mdrl RNA干扰真核表达载体的构建

刘霆, 顾玲m刘霆△, 龚玉萍, 王玉芳, 杨志梅, 席亚明

四川生理科学杂志,2005,27(1):6~9,-0001,():

摘要

目的:构建抗mdr1 RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdrl的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgen~il.1栽体中,转化大肠杆菌DH5a,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:用PstI和Sail酶切鉴定质粒Pmdrlshl、Pmdrlsh2、Pmdrlsh3均符合设计要求。测序证实序列完全正确。结论:通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdrlshl、Pmdrlsh2、Pmdrlsh3插入位点正确,与设计序列一致,预期可用于逆转mdrl所致耐药。

关键词: mdrl基因, RNA干扰 真核表达载体

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2007年11月26日

【期刊论文】腺病毒载体介导的RNAi对SK-BR-3细胞c-Met表达的影响

陈东, 赵慧, 袁振华, 王忠山, 吴小兵

解剖学杂志2006年第29卷第5期/CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol. 29, No. 5, 2006,-0001,():

摘要

目的:通过腺病毒载体介导的RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞HGF受体c-Met的表达,抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。方法:PCR法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet;利用腺病毒载体将其传递至SK-BR-3细胞;RNA狭缝杂交检测SK-BR-3细胞c-Met mRNA水平,Western印迹检测c-Met蛋白水平。结果:获得了带有人U6启动子及c-Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了重组腺病毒的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA和蛋白相对表达量均有所下降。结论:腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c-Met表达,能在一定程度上阻断HGF-c-Met信号转导通路,有可能成为对乳腺癌进行基因治疗的有效载体。

关键词: c-Met, 肝细胞生长因子, 腺病毒, RNA干扰

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2007年11月20日

【期刊论文】RNA 干扰对活化的小鼠巨噬细胞TNFα表达的影响

李瑜元, 谭兵, 周永健, 聂玉强, 杜艳蕾

中华医学杂志2007; 87 (30); 2140,-0001,():

摘要

目的 观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰RNA对体外小鼠巨噬细胞系RAW264.7表达TNF-α的抑制作用。方法: 采用化学法合成针对TNF-αmRNA不同位点设计的3条siRNA序列和一条带有荧光标记的BLOCK-ITTM Fluorescent Oligo(修饰的荧光标记的dsRNA)通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7,同时设立一个无任何靶基因的siRNA做为阴性对照(siRNA4)。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;用实时荧光定量 PCR和ELISA法分别检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果内毒素刺激后6 h ,巨噬细胞表达TNF-αmRNA 和合成分泌的TNF-α量均增加,于9 ~12 h 达 高峰。利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达72%~80%。siRNA1-4转染巨噬细胞后,与未转染组(TNF-αmRNA 0.2935±0.1470,蛋白2104±32pg/ml)相比,siRNA2、3可见内毒素刺激的TNF-αmRNA(0.1576±0.0308、0.1140±0.0277)和TNF-α蛋白表达[(1355± 348)pg/ml、(817±138)pg/ml]均减少(均P< 0.05),其中siRNA3的抑制率非常显著,达61.2%(P< 0.01)。阴性对照siRNA4对细胞基因及蛋白表达无影响。结论内毒素可刺激小鼠巨噬细胞TNF-α的合成。化学合成siRNA转染小鼠巨噬细胞有较高的转染效率,能有效抑制 TNF-αmRNA及蛋白的表达。

关键词: RNA干扰 小干扰RNA, 巨噬细胞, 肿瘤坏死因子α

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2011年03月25日

【期刊论文】芽殖酵母和裂殖酵母中异染色质形成机制

黄鹰, 于莹莹, 杨景

中国生物化学与分子生物学报,2008,24(8):692~697,-0001,():

摘要

芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是用来研究异染色质形成、细胞周期、DNA复制等重要细胞功能的理想单细胞真核生物。本文主要介绍这2种酵母中异染色质形成的机制。异染色质是一种抑制基因转录和DNA重组的特殊染色质结构。尽管在芽殖酵母和裂殖酵母中异染色质形成都需要组蛋白修饰,但异染色质建立的机制不同。在芽殖酵母中参与异染色质形成的主要蛋白是Sir124蛋白(其中Sir2为组蛋白H3去乙酰化酶),而组蛋白H3赖氨酸9甲基化酶Clr4和异染色质蛋白Swi6在裂殖酵母异染色质形成中起关键的作用。在这两个酵母中,参与异染色质形成的组蛋白修饰蛋白由DNA结合蛋白招募到异染色质。此外,裂殖酵母也利用RNA干扰系统招募组蛋白修饰蛋白。

关键词: 酵母, 表观遗传, 异染色质, RNA干扰 组蛋白修饰

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2006年11月02日

【期刊论文】RNA干扰技术抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的初步研究

葛坚, 黄圣松, 王莉娜, 尹心宝, 魏雁涛, 马萍

中华眼科杂志,2005,41(12):1076~1081,-0001,():

摘要

目的探讨RNA干扰技术对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的抑制作用。方法采用化学合成的靶向IKK2β的siRNA,转染体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞,同时以对任何基因均无作用的siRNA作为阴性对照。以逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)技术检测IKK2βmRNA表达水平,免疫印迹法检测IKK2β蛋白表达水平。将siRNA的转染浓度分别设为5、10、25、50、100、200nmol/L,进行转染,于转染后48h采用四甲基偶氮唑盐法检测其转染后对成纤维细胞的抑制作用。结果 经转染了靶向IKK2β的siRNA,其成纤维细胞IKK2β的mRNA和蛋白表达水平均受到抑制。各个转染浓度(5、10、25、50、100、200nmol/L)均可抑制成纤维细胞的增殖(P<0.05),抑制率分别为10.72%、23.35%、30.84%、51.25%、50.06%、49.63%,50nmol/L时已达最大抑制率。结论靶向IKK2β的siRNA转染可以降低IKK2β的表达水平,同时对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖具有抑制作用。抗IKK2β的RNA干扰技术可能是抑制抗青光眼术后滤过道瘢痕化的新手段。

关键词: RNA干扰  蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶,  筋膜,  成纤维细胞,  细胞分裂,  青光眼

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2006年07月31日

【期刊论文】RNA干扰技术抑制A549细胞表皮生长因子受体表达的研究

白春学, 张敏, 张新, 陈杰, MinQ. Wei

中华肿瘤杂志,2004,26(12):713-716,-0001,():

摘要

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达后,对A549细胞生物学特性的影响。方法:体外化学合成EGFR 序列特异性双链RNA(dsRNA),用Lipofectamine 2000 转染A549细胞,采用Western blot技术和流式细胞仪检测EGFR的表达,并观察A549细胞周期、集落形成、化疗敏感性等生物学特性的改变。结果:序列特异性dsRNA-EGFR可显著抑制A549细胞EGFR表达;dsRNA-EGFR组细胞生长抑制率为85.0%,集落形成抑制率63.3%;细胞周期分析结果表明,dsRNA-EGFR组G0~G1期细胞数较对照组增加了12.7%,进入S期的细胞数较对照组减少了6.6%。转染dsRNA-EGFR后,可将A549细胞对顺铂的敏感性提高约4倍。结论:dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞EGFR的表达,并将更多的细胞阻滞在G0~G1期,抑制细胞增生,显著增加细胞对顺铂的敏感性。RNAi可能为NSCLC的基因治疗提供新策略。

关键词: 表皮生长因子受体, RNA干扰 双链RNA, 癌,, 非小细胞肺, 肺肿瘤

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2006年07月31日

【期刊论文】RNA干扰技术在哺乳动物中的应用*

白春学, 陈杰**, 张敏

生物化学与生物物理进展,2003,30(4):650-654,-0001,():

摘要

RNA干扰(RNAi)是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制RNAi是由双链RNA触发的转录后基因沉默机制,具有序列特异性,在哺乳动物细胞中,RNAi由21~23个核苷酸组成的双链RNA引发小干扰RNA(siRNA)可以在体外合成或通过表达载体在哺乳动物细胞内合成由于RNAi技术具有快速、简单和特异性强等特点,在基因功能研究、抗病毒治疗和抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景。

关键词: RNA干扰 小干扰RNA, 哺乳动物

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2006年07月07日

【期刊论文】胶质瘤起源细胞与分子病因研究

黄强, 王爱东, 张全斌, 董军, 兰青

中华神经医学杂志,2005,4(3):217-220,-0001,():

摘要

神经干细胞和胶质瘤干细胞的研究成功,对早有定论的胶质瘤起源细胞学说发出了挑战在胶质瘤细胞中,为数不多的千细胞是生成肿瘤的细胞已经证实,但肿瘤干细胞是否起源于神经干细胞仅仅只是推测、两者间的分子关系是研究的切入点,推测调控分子就是胶质瘤发生的分子病因。

关键词: 神经胶质瘤, 分子病因, RNA干扰 基因疗法

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