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2009年04月27日

【期刊论文】SARS冠状病毒M 基因的克隆及其表达*

江丽芳, 晏辉钧, 赵卫, 方丹云, 周经姣, 龙北国, 张文炳, 郭辉玉, 江丽芳**

中国病毒学,2005,20(1):1~4,-0001,():

摘要

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RT PCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZ-B,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P-pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut-菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物。Mut-酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约6kDa和42 kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M 蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。

关键词: SARS冠状病毒, M基因, 克隆 巴氏毕赤酵母, 表达

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2009年04月27日

【期刊论文】登革病毒2型NSI蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察

江丽芳, 高阳, 方丹云, 周俊梅

中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(10):787~791,-0001,():

摘要

目的 以登革病毒2型(dengue virus 2,DV2)结构蛋白(non-structru]protein 1,NSl)为靶基因,构建DV2-NSl的候选DNA疫苗;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用。方法将登革病毒2型NSl/NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上,构建成重组体pCXN2-NSI/NS2a。在体外将重组质粒转染Cos-7细胞,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达。大量提取空质粒和重组质粒,进行动物免疫实验。结果重组质粒可在真核细胞中有效地表达NSI蛋白。免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NSI蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫。末次免疫前已有抗体产生,4周后达高峰。抗体依赖补体介导的溶细胞作用(antibody-dependent comple-ment-mediated cytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用。淋巴细胞增殖实验结果显示,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性。流式细胞计数仪(FAcS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+、CD8+细胞水平有较大升高(P<0.01)。动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,有66.6%的免疫鼠受到保护。结论NSI/NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。这些结果为进一步研制登革病毒DNA疫苗提供了参考依据。

关键词: 登革病毒2型, NSl蛋白, 基因克隆 DNA免疫

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2009年04月27日

【期刊论文】登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

江丽芳, 高阳, 江丽芳**, 方丹云, 曾祥凤

中国病毒学,2003,18(3):201~205,-0001,():

摘要

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCxN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,l5周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1∶640:流式细胞计数仪(FAcs)检测DNA免疫鼠CD4、CD8 T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高(P<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC.I限制性杀伤性CD8 T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。

关键词: 登革病毒2型(, DV2), E蛋白, 基因克隆 DNA免疫

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2009年04月27日

【期刊论文】Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达*

江丽芳, 薛耀华, 魏惠永, 方丹云, 郭辉玉

中国人善共患病杂志,2003,19(6):31~33,-0001,():

摘要

目的 克隆2型登革病毒E基因并用酵母真核表达,获得全长的重组E蛋白,为其结构与功能的研究提供条件。方法 从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清中提取RNA,通过RT-PCR扩增E基因片段,与载体pPICZaB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P. pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut菌诱导表达,SDS-PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果 RT-PCR得到1.5kb的E基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因;Mut 酵母转化菌可分泌表达约69kDa的蛋白,与DEN2 E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论 成功将克隆的全长DEN2 E基因在酵母菌中表达,获得的重组E蛋白具有免疫反应性。

关键词: 登革病毒, E基因, 克隆 酵母菌, 表达

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