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2011年05月27日

【期刊论文】酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

游松, 蒋雅红, 任杰, 谢兰漪

沈阳药科大学学报,2002,19(4):291~293,-0001,():

摘要

目的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的克隆和表达。方法利用PCR技术从酿酒酵母的总cDNA中钓取出PDCsc基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。结果扩增出长约1.7kb的PDCsc基因,成功构建其表达质粒pSC-22b,对转化菌株的SDS-PAGE分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的18.6%。结论成功构建高效表达PDCsc基因的工程菌株,为实现利用PDCsc进行的生物转化奠定基础。

关键词: 酿酒酵母, 丙酮酸脱羧酶, 克隆 高交表达

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2011年04月29日

【期刊论文】苦瓜 MAP3D基因原核表达载体的构建和PCR快速检测重组子的研究

胡忠, 庄东红, 欧阳永长

遗传,2004,26(5):701~704,-0001,():

摘要

根据已报道的序列,把苦瓜(Momordica charantia)MAP30基因成功克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并对PCR快速检测阳性克隆进行了研究。结果表明,直接用菌落、菌液、酚氯仿处理过的菌液,以及提取的质粒进行PCR都可以成功地筛选阳性菌落。其中,酚氯仿处理过的菌液PCR与质粒PCR的结果最接近,而且比质粒PCR简单,因此可作为方便可靠的阳性克隆筛选的新方法。

关键词: MAP30, PCR, 克隆子筛选, 苦瓜

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2011年04月25日

【期刊论文】梨α-法尼烯合成酶基因的克隆及其序列分析

张元湖, 陈新, 刘庆忠, 张建鹏, 吕慧贞, 李玲玲, 李萌

生物技术通报,2007,(5):113~115,-0001,():

摘要

利用RT-PCR技术从鸭梨的果皮中获得了一个全长为1824bp的α-法尼烯合成酶基因(α-Farnesene Synthase, PFS)克隆,该cDNA包含一个由1728个核苷酸组成的开放阅读框架,编码分子量约66kDa的576十氨基酸残基的蛋白质。序列相似性分析结果表明,它与苹果中克隆到的AFS1基因具有很高的同源性,核苷酸序列一致性为97.34%,且真有典型的萜类合成酶基因保守结构域。与来源于黄瓜、杉树、松树的α-法尼烯合成酶基因的同源性较低。

关键词: 鸭梨 α-法尼烯合成酶 基因克隆 序列分析

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2011年03月28日

【期刊论文】水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备*

张炜, 程彦伟**, 李亮**, 沈嵘, 齐耀程, 刘晓宇, 王宁, 张炜***

生物化学与生物物理进展,2008,35(9):1077~1083,-0001,():

摘要

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%。重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20000效价的多克隆抗体。Western blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白。

关键词: LRR型类受体蛋白激酶,, 水稻,, 原核表达,, 克隆抗体

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2011年03月21日

【期刊论文】犬白细胞介素一2基因(IL-2)的克隆与表达

李祥瑞, 魏晓锋, 李春华, **徐立新

农业生物技术学报,2004,12(3):268~272,-0001,():

摘要

根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)IL-2基因序列,设计了1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为550 bp。分离纯化片段,克隆人pMD18-T载体,经酶切鉴定,测序结果显示,克隆的犬IL-2基因与GenBank上发表的序列一致,生物软件分析结果表明该序列与牛、羊和鹿的亲源性更近。构建表达质粒pET28-CaIL-2,转化大肠杆菌(Eschetichia coli)BL21,IPTG诱导表达,SDS-DPAGE电泳显示21.8kD左右的表达条带。MTT比色法测定活性结果表明:表达的重组犬IL-2蛋白具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性。

关键词: 犬, IL-2基因, 克隆 表达

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2011年03月21日

【期刊论文】鸡白细胞介素-2cDNA克隆*

李祥瑞, 金红, 卢景良

南京农业大学学报,22(2):80~84,-0001,():

摘要

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡IL 22 cDNA。以Con A(20 Lg/mL)诱导SPF 鸡脾脏淋巴细胞,第20小时 收集细胞,提取mRNA,以Super Scrip t P lasm id System fo r cDNA Synthesis 试剂盒合成cDNA,定向连结于穿梭质粒pSV·Sport I,构建cDNA 文库。将文库分组提取重组质粒,转染CO S27 细胞,表达cDNA s。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物IL 22 活性。经过3轮筛选,获得14个具有IL 22活性的克隆。选择其中4个进行酶切分析,结果显示这4个cDNA大小分别为1.5,1.0,0.8和0.8kb。

关键词: 鸡, 白细胞介素22, cDNA, 克隆

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2010年12月16日

【期刊论文】A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体的制备及其对应表位的初步鉴定①

魏林, 马翠卿, 顾海燕, 郭奕阳, 胡光磊, 魏澎

中国免疫学杂志,2008,24(11):1046~1048,-0001,():

摘要

目的:制备抗A组溶血性链球菌(GAS)表面蛋白Fba(fibronectin-binding proteins a)的单克隆抗体(mAb),并对单抗的生物学功能及其相应表位进行了初步鉴定。方法:以重组Fba蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术及间接ELISA筛选出针对Fba的杂交瘤细胞株,以Western blot鉴定mAb的特异性,并将获得的mAb与Fba+GAS和Fba-GAS分别行全菌ELISA、与Fba的分段表达蛋白行Western blot,初步鉴定mAb针对的表位所在区域。结果:获得了稳定分泌抗Fba-mAb的杂交瘸细胞株,其中一株mAb能特异结合天然Fba+链球菌,且该单抗针对的表位包含了Fba蛋白的第104~108位氨基酸,该位点也是链球菌Fab蛋白结合补体调节蛋白FH的位点。结论:成功地制备了抗GAS表面Fba蛋白的mAb,其中一株mAb对应的表位为位于菌体表面的天然表位,并检测出了该mAb对应的表位所在区段,这为深入研究GAS的致病机制提供了有力工具。

关键词: A族链球菌, Fba蛋白, 克隆抗体, 表位

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2010年12月16日

【期刊论文】A族链球菌(GAS)Fba蛋白单克隆抗体对应表位核心氨基酸的确定①

魏林, 郭奕阳, 马翠卿, 魏澎, 王秀荣, 冯惠东, 阎婉依

中国免疫学杂志,2009,25(12):1059~1062,-0001,():

摘要

目的:对A族链球菌Fba蛋白McAb2所对应的表位进行定位。方法:以初步定位的表位区段为线索合成三段重叠多肽,dot-ELISA检测McAb2与合成肽的亲合力,并以McAb2为靶分子,利用噬菌体随机七肽库进行亲和筛选,用竞争ELISA鉴定阳性克隆。结果:dot-ELISA检测结果表明Fba100-112肽段与McAb2的结合能力最强。经过3轮亲和筛选后,随机挑选20个噬菌体克隆,竞争ELISA对其与McAb2的亲和力做检测,其中12个克隆显示较强的阳性结果。阳性克隆DNA测序,与Fba基因第100位氨基酸至110位氨基酸中ITPDL同源性较高。结论:通过dot-ELISA将A族链球菌Fba蛋白McAb2对应的表位定位于100~112位氨基酸,结果同噬菌体随机肽库筛选的核心氨基酸位置吻合。为进一步研制表位肽疫苗、研究Fba蛋白及其单克隆抗体的生物学功能奠定了基础。

关键词: A族链球菌, Fba蛋白, 克隆抗体, 表位, 噬菌体肽库

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2010年12月15日

【期刊论文】沙眼衣原体CT-249 基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白

刘殿武, 贾天军, 刘殿武*, 罗建华, 钟光明

微生物学报,2007,47(4):645~658,-0001,():

摘要

使用融合蛋白GST-CT249的抗体对假想蛋白CT249的特性进行研究。使用RCR方法从L2型沙眼衣原体的基因组中扩增编码CT249蛋白的开放读码区基因,限制性内切酶BamHI和NotI消化、T4连接酶连接导入pGEX-6p2载体,进一步把重组质粒pGEX-6p2-CT249转化到XLI-hlue细菌,并诱导表达融合蛋白GSF-CT249。在融合蛋白GST-CT249免疫小鼠制各抗体后,应用直接免疫荧光技术对衣原体感染细胞内的CT249基因表达的内源性蛋白进行初步定位。成功克隆出沙眼衣原体基因CT249,全长为35lbp,并表达了融合蛋白GSF-CT249,分子量为38.2kDa。制各了融合蛋白GSFCT249的抗体并初步定位假想蛋白CT249于沙眼衣原体包涵体膜蛋白上。总之。使用融合蛋白GSF-CT249的抗体,鉴定假想蛋白CT249为一种新的沙眼衣原体包涵体膜蛋白。该发现将为进一步深入研究衣原体与宿主细胞间某些机制提供了有用的途径。

关键词: 沙眼衣原体, 融合蛋白, 克隆 表达, 包涵体膜蛋白

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2010年12月15日

【期刊论文】肺炎衣原体CPn0308 的基因克隆及其内源性蛋白定位的研究

刘殿武, 贾天军, 罗建华, 张庶民, 钟光明

卫生研究,2008,37(2):219~222,-0001,():

摘要

目的 克隆肺炎衣原体基因CPn0308,表达融合蛋白,并制备抗体对其表达的内源性蛋白进行初步定位。方法 根据STD基因库提供的信息设计引物,聚合酶链反应(PCR)克隆目的基因,用BamHI/NotI对克隆的目的基因和pGEX-6P2 载体进行酶切,T4 连接酶连接后,重组质粒经42℃转化XL1-blue 细菌:用PCR进行初步筛选,交叉PCR对提取质粒进一步确定,最后对插入片断进行序列分析:用IPTG诱导阳性克隆的细菌使其表达GST融合蛋白,纯化后免疫小鼠制备抗体,使用IFA 对内源性蛋白进行定位分析。结果 克隆出肺炎衣原体基因CPn0308,全长为366bp,编码121个氨基酸;并表达了融合蛋白GST-CPn0308,分子量约为39kD;制备了抗体,IFA实验发现该蛋白初步定位于肺炎衣原体包涵体膜蛋白上。结论 成功克隆肺炎衣原体基因CPn0308,其内源性蛋白初步定位于肺炎衣原体包涵体膜上。

关键词: 肺炎衣原体, 基因克隆 内源性蛋白

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2010年12月07日

【期刊论文】红巴梨f3h基因的克隆及植物表达载体的构建*

吴少华, 张大生, 崔丽洁, 王景明, 吴少华*

南京林业大学学报(自然科学版),2005,29(2):65~68,-0001,():

摘要

以成熟红巴梨果皮的总RNA为模板,根据仁果类果树的f3h基因的保守序列设计引物,利用RT-RCR方法从果皮中克隆出花青素生成相关基因f3h基因的全长cDNA并将该片段连接到pGEM-Teasy载体中,核苷酸序列测定表明,该基因全长1095bp,与苹果的f3h基因同源性高达92%,与矮牵牛相似系数达83%与拟南芥相似系数达到82%。利用EcoRV和BglII对重组质粒进行酶切,回收1095bp条带,并将其连接到pBIl21载体上,通过抗性筛选和PCR检测,证实了f3h基因已经构建到植物表达载体pBIl21上。

关键词: 花青素, f3h基因, 克隆 载体

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2010年12月07日

【期刊论文】龙眼LEAFY同源基因片段的克隆和表达

吴少华, 曾黎辉, 王庆莲, 洪自同, 吴少华*

热带作物学报,2006,27(4):69~73,-0001,():

摘要

研究克隆的龙眼(Dimdcorpus longan Lour.)LFY同源基因(LLFY)保守区片段在不同组织器官以及“冲梢”逆转成的营养芽中的表达情况,为进一步鉴定龙眼LFY同源基因的功能及分析其在龙眼花序的“冲梢”过程中的作用机理奠定基础。根据不同物种LEAFY同源基因保守区序列设计简并引物,从“红核子”龙眼(D.longan Lour. cv. Red Seed)中克隆了425 bp的cDNA片段。同源性比较结果表明,获得的序列为龙眼LEAFY同源基因(LLFY);同时还获得了1816 bp的LLFY基因组序列片段并进行了序列分析。通过RT-PCR研究LLFY在6种龙眼不同组织器官的表达发现,LLFY在花序芽和花芽中的表达量最高,叶芽中有微量表达,叶片和茎段中没有表达;在“冲梢”逆转成的营养芽中,LLFY的表达量明显高于叶芽。

关键词: 龙眼, LEAFY, 同源基因, 克隆RT-PCR, 表达

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2010年11月18日

【期刊论文】番茄衰老相关蛋白SENU3在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

王傲雪, 赵永娟 王傲雪, 贾琪, 华子春

植物生理学通讯,2005,41(5):208~110,-0001,():

摘要

研究了SENU3蛋白表达载体的构建、大肠杆菌表达、纯化及其抗体的制备。

关键词: 番茄衰老相关蛋白SENU3, 原核表达, 割胶., 电洗脱法, 克隆抗体

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2010年10月19日

【期刊论文】黄河三角洲湿地土壤微生物群落结构分析*

吴晓磊, 刘芳, 叶思源, 汤岳琴, 滝川清, 木田建次, 吴晓磊**

应用与环境生物学报,2007,13(5): 691~696,-0001,():

摘要

采用末端限制性片段长度多态性分析(T2RFLP)技术和16S rDNA克隆文库的方法, 分析了黄河三角洲滨海湿地土壤不同深度细菌和古菌的群落结构。研究表明, 随着深度的增加, 细菌群落的多样性下降, 而古菌群落多样性则有上升的趋势, 且土壤的细菌和古菌群落结构都呈现出规律的层状分布。该土壤包括各种硫酸盐还原菌、产甲烷古菌、光合细菌等丰富的细菌和古菌资源。

关键词: 滨海湿地, 微生物群落结构, 末端限制性片段长度多态性分析, 16S rDNA 克隆文库, 种群多样性

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2010年08月31日

【期刊论文】蜡样杆菌(Bncillus ereus)M22 Mn-SOD cDNA片断的克隆

王琦, 惠芳, 尚玉磊, 王琦*, 王慧敏, 梅汝鸿

微生物学杂志,2004,24(3):8~11,-0001,():

摘要

析不同种细菌Mn-SOC氨基酸序列的保守区域,设计一对简并引物进行RT-PCR扩增,产物经T-A载体连接转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆、测序并进行同源性分析,得到436 bp Mn-SOD cDNA片段。根据此片段设计5′端特异性引物,然后进行5′RACE扩增,获得Mn SOC 5′端387 bp cDNA片断。将2段序列进行拼接获得594 bp cDNA片断,编码172个氨基酸。对推定氨基酸序列进行BLAST分析,结果表明其与炭疽芽孢杆菌(岛Bacillus anthracis)同源性为95%,且Gly77,Aly78,phes86,G1n150和Asp151在已报道的Mn-SOD中均存在,构成Mn-SOD的活性中心。表明该序列为蜡样芽孢杆菌Mn-SOD的cDNA序列。

关键词: 样芽孢杆菌(, Bacillus cereus), Mn-SOD, eDNA, 克隆 分析

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2010年06月02日

【期刊论文】基于改进免疫算法的电力系统无功优化

郭创新, 朱承治, 赵波, 曹一家

电力系统自动化,2005,29(15):23~29,-0001,():

摘要

在克隆选择原理的基础上提出了一种改进的免疫算法用于求解电力系统无功优化问题。该算法在上一代最优抗体的基础上,构造了一个较小的细胞克隆半径和一个较大的高频变异半径,即通过一个较小领域范围和一个较大领域范围的并行搜索,使该方法在加强对问题局部搜索的同时兼顾了全局搜索,有效地提高了算法的收敛速度和精度。通过对马尔可夫链的分析,证明了该算法的全局收敛性。对无功优化问题中离散变量的处理,提出了一种简单的“切割”技术,仅在适应值评估时对优化的离散变量进行“切割”。最后,对标准IEEE30节点系统和一个实际的118节点系统进行仿真,结果表明,该算法具有最优解质量高、收敛特性好的优点,有较强的实用意义。

关键词: 免疫算法, 克隆选择原理, 无功优化, “切割”技术

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2009年11月09日

【期刊论文】新疆甜瓜Fom-2基因同源序列的克隆及分析

李冠, 赵惠新, 李冠* 马东建, 王贤磊

,-0001,():

摘要

近年来甜瓜枯萎病蔓延迅速,危害严重,分离克隆甜瓜抗病基因,利用转基因技术改良甜瓜抗病品性是一种从根本上解决甜瓜枯萎病危害的新途径。根据已知Fom-2基因序列设计特异引物,采用RT - PCR技术从新疆甜瓜抗瘸性品种黄邑子中扩增出580bp的cDNA片段,序列分析表明它与已发表Fom-2基因具有高度同源性基因片段,命名为X-Fom-2。以X-Fom-2为探针对新疆甜瓜黄旦子、伽什瓜、红心脆、金丽-2号进行Southem blot和NoIthem blot,结果表明,X-Fom-2以多拷贝形式存在。X-Fom-2在抗病品种黄旦子、金丽2号有表达且在病原菌诱导后增强,而在感病品种伽什瓜、红心脆中没有表达。

关键词: 甜瓜, 枯萎病, Fom-2基因, 基因克隆 表达分析

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2009年11月03日

【期刊论文】含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义

周岐新, 章涛, 杨贵忠, 袁野, 万敬员, 杨俊卿, 蒋建新, 周岐新*

解剖学报, 2007, 38(2):173~177,-0001,():

摘要

目的构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。方法 采用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、Sa/I相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测。结果 经酶切和测序证实重组赝粒构建正确,并在转染的293细胞巾获得hPPAR6的高效表达。结论 成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒。

关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体δ, 基因克隆 真核表达, 逆转录-聚合酶链反应

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2009年11月03日

【期刊论文】携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

周岐新, 章涛, 杨贵忠, 袁野, 李苌清, 万敬员, 蒋建新

中国药理学通报,2007,23(3): 413~417,-0001,():

摘要

目的 构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αahPPARa)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARa受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHI、SalI双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRE52-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα綦因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果 经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论 成功构建重组质粒phPPARa-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。

关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体d, 基因克隆 真核表达

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2009年11月02日

【期刊论文】CD40L单克隆抗体对HSP患儿PBMC及单核细胞株THP一1产生炎症因子的影日

杨锡强, 李秋, 王利佳

中华微生塑堂塑免疫学杂志,2003,11(23):891~894,-0001,():

摘要

目的观察CINO配体单克隆抗体(CINOL McAb)对HsP(亨诺一许兰紫癜)患儿PBMC及单核细胞株THP-1产生炎症因子的影响。方法采用细胞培养、流式细胞技术及ElJSA法分别检测正常对照、过敏性紫癜患儿的PBMc及单核细胞株THP-1表达膜蛋白分子CINOL、CINO的阳性率、产生炎症因子IL-1、 TNF-α、IL-6水平以及CINOL McAb加入细胞培养体系后上述指标的变化。结果与正常比较,脚患儿的PBMc表达CD40L[(8.26±4.15)%,对照(0.54±0.58)%]显著增高、CINO表达无差异;PBMc培养上清中炎症因子IL广1[(1000.4±574.5)pg/ml,对照(246.8±207.1) ]、 INF-α[(978.7±205.8)pg/ml,对照(452.4±248.5)pg/m1]的水平也显著高于对照,CD40L McAb可使增高的IL-1[(164.7±127.9)pg/ml]、 TNF-α[(674.7±269.2)pg/m1]降至正常水平。THP-1自发表达CINO,低浓度产生IL-1、TNF-α。与正常比较,HSP患儿的PBNC培养上清诱导其表达CD40,产生IL-1,TNF-α增高,CI40L McAb同样具有抑制THP-1表达CD40、分泌IL-1、 TNF-α的作用。结论 CINOL McAb能抑制炎症因子的产生。

关键词: 过敏性紫癜, CD40配体单克隆抗体, CINO配体

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