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2009年10月21日

【期刊论文】pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

王一飞, 董晓, 王家宁黄永章郭凌郧

郧阳医学院学报,2005,24(6):321~325,-0001,():

摘要

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“ ,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5ct,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP用XhoI和BamH1分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP eDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5ct并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基p-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)进行N一树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结杲:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP eDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP eDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BI21(DE )并经诱导后得到高效表达,表达量可达66me,/100ml菌液,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。

关键词: TA克隆载体, 增强型绿色荧光蛋白(, EGFP), 重组质粒, 蛋白表达, 蛋白纯化

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2005年03月04日

【期刊论文】DLI治疗CML病人的克隆性增殖TCR Vβ细胞分析①

李扬秋, 杨力建, 陈少华, 张涛, 许敏华, 罗更新

Applied Mathematics and Merchanics (English Edition. Vol. 15. No.3. Mar. 1994),-0001,():

摘要

目的:了解供者淋巴细胞输注(DLI)后,产生GVL 效应的克隆性TCR Vβ亚家族T细胞的情况。方法:利用RT-PCR分别扩增2例CML 经allo-BMT后复发病人DIL治疗前后不同时间外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞克隆性。结果:DLI治疗前病人外周血仅表达4~11个Vβ亚家族,而DLI治疗后缓解期则可检测到12~21个Vβ亚家族。基因扫描显示DLI后病人外周血出现某些新的Vβ亚家族克隆性增殖T细胞。结论:病人的TCR Vβ亚家族T细胞存在倾斜性分布现象,该倾斜现象在完全缓解时逐步恢复正常。DLI治疗病人时,可能通过某些克隆性增殖TCR Vβ亚家族T细胞而发挥GVL作用。

关键词: 供者淋巴细胞输注,, 慢性粒细胞白血病,, T细胞受体β基因,, T细胞克隆,, 异基因骨髓移植

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2005年03月04日

【期刊论文】利用基因扫描分析TCR VB亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

李扬秋, 汪明春, 吴幼华

〔Ch inese J ou rna l of Imm unology, 1998; 14 (1): 48〕,-0001,():

摘要

分析了健康人、T-ALL外周血及T细胞株Mo lt-4和Jurkat中TCRVBT细胞的表达和克隆性。应用RT-PCR扩增TCR V B24个亚家族的CDR3, 并经基因扫描和序列分析确定T细胞克隆性。结果表明健康人表达除V B20外的多克隆T细胞;T 2ALL仅表达3~4个V B亚家族T细胞;部分呈寡克隆性;Mo lt-4和Jurkat分别表达V B2和V B8单克隆T细胞。T-ALL中存在克隆性生长T细胞。该方法是检测T细胞克隆性的敏感和精确的方法。

关键词: TCR V B基因,, 互补决定区3(, CDR3), ,, 基因扫描,, T细胞克隆性,, 白血病

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2005年03月04日

【期刊论文】CML病人TCR VB21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

李扬秋, 陈少华, 杨力建, 祁明芳

MMUNOLOGICAL JOURNAL Vol 16 No 3 May 2000,-0001,():

摘要

目的分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T 细胞及其CDR3序列的特点。方法利用RT-PCR扩增3例CML外周血单个核细胞中24个TCR V B基因的CDR3, 了解TCR V BT细胞的分布。阳性产物进一步经基因扫描分析, 了解其克隆性。寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果3例病人仅存在3~9个TCR V B亚家族T细胞, 部分V B亚家族T细胞呈寡克隆性增殖,V B21的寡克隆T细胞见于全部的3例病人中。结论CML病人外周血TCR V B亚家族T细胞出现倾斜性分布和克隆性增殖,这可能是CML中机体对恶性细胞所引起的特异性免疫反应, 但对不同病人的V B21寡克隆T细胞序列分析并未能发现完全同源的CDR3序列。

关键词: T细胞受体VB基因, 互补决定区3, T]细胞克隆 白血病

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2005年03月04日

【期刊论文】应用RT2PCR和基因扫描分析TCR Vβ谱系的CDR3长度了解急性单核细胞白血病病人克隆性增殖T细胞

李扬秋, 杨力建, 陈少华, 李荣福, 张玉平, 卢育洪, 罗更新

Chinese Medical Journal 2002; 115 (1): 69-71,-0001,():

摘要

目的了解急性单核细胞白血病(AML2M5)病人TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法利用RT2PCR分别扩增9例M5病人外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3,了解TCR Vβ谱系的表达情况。PCR产物进一步经基因扫描分析,确定T 细胞克隆性。结果9例AML2M5病人仅存在1210个Vβ亚家族T细胞,而正常血标本则可检测到24个Vβ亚家族。基因扫描分析显示:8例病人的某些Vβ亚家族出现一主峰图象(寡克隆性T细胞)。Vβ2寡克隆T细胞发现于6例病人中。结论 结果提示AML2M5病人存在克隆性增殖的T细胞,主要为Vβ2亚家族,推测这可能是对白血病细胞(M5)相关抗原的特异性免疫反应并可能具有抗白血病的活性。

关键词: T细胞受体Vβ基因,, AML-M5,, T细胞克隆

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2005年03月04日

【期刊论文】基因扫描分析一例cGVHD病人稳定性克隆性扩增的TCR Vβ6,Vβ17和Vβ19T细胞

李扬秋, 杨力建, 陈少华, 杜欣, 许敏华, 张涛

Chinese Medical Journal 2001; 114 (5): 489-492,-0001,():

摘要

目的分析慢性移植物抗宿主病(cGVHD)中TCR Vβ谱系的分布和克隆性。方法应用RT2PCR扩增一例CML异基因骨髓移植后cGVHD病人第35,39,43 和45个月的外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族的CDR3,了解病人TCR VβT细胞的表达,PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性。结果 cGVHD病人每个标本存在14216个Vβ家族T细胞;寡克隆T细胞可见于Vβ6,16,17,19 和21亚家族,稳定性克隆性TCR Vβ6、17和21 T细胞可见于全部标本。结论 cGVHD病人存在倾斜性分布和克隆性生长T细胞,它可能与cGVHD的发生有关。

关键词: TCR Vβ基因,, 基因扫描,, T细胞克隆性,, 移植物抗宿主病

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2008年01月29日

【期刊论文】小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

沈丽佳, 方唯意, 谢思明, 何滢, 蒋会勇, 赵彤

南方医科大学学报(J South Med Univ) 2006; 26(2),-0001,():

摘要

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA.克隆AT载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xhol双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与pcDNA3.1/MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结呆与GenBank提供的已知序列(NM_138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3.1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较.100%同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3.1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

关键词: 淋巴瘤, A20细胞株, mCD99L2, 基因克隆 真核表达载体

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