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2011年03月21日

【期刊论文】犬白细胞介素一2基因(IL-2)的克隆与表达

李祥瑞, 魏晓锋, 李春华, **徐立新

农业生物技术学报,2004,12(3):268~272,-0001,():

摘要

根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)IL-2基因序列,设计了1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为550 bp。分离纯化片段,克隆人pMD18-T载体,经酶切鉴定,测序结果显示,克隆的犬IL-2基因与GenBank上发表的序列一致,生物软件分析结果表明该序列与牛、羊和鹿的亲源性更近。构建表达质粒pET28-CaIL-2,转化大肠杆菌(Eschetichia coli)BL21,IPTG诱导表达,SDS-DPAGE电泳显示21.8kD左右的表达条带。MTT比色法测定活性结果表明:表达的重组犬IL-2蛋白具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性。

关键词: 犬, IL-2基因, 克隆 表达

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2011年03月21日

【期刊论文】鸡白细胞介素-2cDNA克隆*

李祥瑞, 金红, 卢景良

南京农业大学学报,22(2):80~84,-0001,():

摘要

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡IL 22 cDNA。以Con A(20 Lg/mL)诱导SPF 鸡脾脏淋巴细胞,第20小时 收集细胞,提取mRNA,以Super Scrip t P lasm id System fo r cDNA Synthesis 试剂盒合成cDNA,定向连结于穿梭质粒pSV·Sport I,构建cDNA 文库。将文库分组提取重组质粒,转染CO S27 细胞,表达cDNA s。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物IL 22 活性。经过3轮筛选,获得14个具有IL 22活性的克隆。选择其中4个进行酶切分析,结果显示这4个cDNA大小分别为1.5,1.0,0.8和0.8kb。

关键词: 鸡, 白细胞介素22, cDNA, 克隆

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2007年05月28日

【期刊论文】海兰鸡白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析

崔保安, 陈红英, 黄青云, 李新生, 王学斌

中国预防兽医学报2006年1月第28卷第1期/Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Jan., 2006, Vol. 28, No. 1,-0001,():

摘要

白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)是一种能诱导产生IFN一y的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应( RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597bp,与在GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。

关键词: 鸡IL-18基因, 克隆 序列测定

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2007年05月28日

【期刊论文】猪伪狂犬病病毒单抗双夹心ELISA的构建

崔保安, 祁小乐, 牛春玲, 王莉娟, 刘占通

河南农业大学学报2004年12月第38卷第4期/Journal of Henan Agricultural University Dec., 2004, Vol. 38, No. 4,-0001,():

摘要

建立了检测猪伪狂犬病痛毒(Pseudo rabies virus,PRV)的单克隆抗体双夹心酶联免疫吸附试验(Enzyme-Iinked immunosor-bent assay,ELISA)方法,为该病的快速诊断奠定了基础,作者对其组装条件进行了筛选,认为兔抗PRV IgG最佳包被质量浓度为4.59mg·L-1;抗PRV的单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb)的最佳质量浓度为6.45mg·L-1;最佳封闭剂为10gL-1BSA(牛血清白蛋白),封闭时问为60min,制定了科学的结果判定标准,最低病毒检出量为200µg·L-1.与病毒分离、动物试验和中和试验相比较,该方法特异、灵敏、可靠、方便。

关键词: 猪伪狂犬病病毒, 克隆抗体, 双夹心ELISA

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2007年05月28日

【期刊论文】伪狂犬病病毒gD、gE基因的克隆及转移载体的构建

崔保安, 胡涛, 杨明凡, 王学斌, 张素梅, 王岩

中国预防兽医学报2004年3月第26卷第2期/Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Mar., 2004, Vol. 26, No. 2,-0001,():

摘要

利用PCR扩增了伪狂犬病病毒Min-A株gD、gE基因,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体。将gD、gE基因连接于质粒pUC18获得pUgDgE,缺失质粒pUgDgE的BamHI和BstEII位点间391bp的片段。在此缺失位置插入来自质粒pcD-NA3.1.的一段含hCMV启动子、多克隆位点和Neo报告基因的片段,构建了通用转移载体pgD-M-gE。该转移载体缺失了伪狂犬病病毒gl基因和gE基因ORF5’端363 bp的碱基,有II个酶切位点可供外源基因的插入,上下游侧翼分别为1.25bp和1.42bp。这为开发以伪狂犬病病毒为载体的多价基因工程疫苗提供了有力工具。

关键词: 伪狂犬病毒, gD, gE, 克隆 通用转移载体

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2007年05月28日

【期刊论文】伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析

崔保安, 胡涛, 王岩, 杨明凡, 王学斌, 张素梅

河南农业大学学报2004年3月第38卷第1期/Journal of Henan Agricultural University Mar., 2004, Vol. 38, No. 1,-0001,():

摘要

参考CeneBank收录的伪狂犬病病毒TK基因的序列设计了l对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy栽体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含1个957bp的开放性阅读框(ORF),编码318个氨基酸组成的多肽,在TK ORF上游.22,-166,-199位存在3个GC框样序列,在终止密码子下游第110个核苷酸处的l306位存在有多聚腺苷加尾信号.PRV Min-A株与PRV Ea株、NIA-3株TK的核苷酸同源性分别为98.4%,97.9%;推导氨基酸的同源性分别为97.8%,97.2%.通过对a疱疹病毒TK氨基酸进行多序列比较,获得了在PRV TK氨基酸序列上的6个保守区间推测这些保守氨基酸对于胸苷激酶(TK)结构的稳定性和催化活性的发挥是必需的。

关键词: 伪狂犬病毒, 胸苷激酶, 克隆 序列分析

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2005年02月24日

【期刊论文】鸡IL218基因的克隆与序列测定

黄青云, 温纳相, 陈金顶, 曹素芳

动物医学进展,2003,24 (2):64~66,-0001,():

摘要

根据Genbank发表的鸡IL-18基因序列,设计一对引物,提取鸡脾细胞总RNA,经RT-PCR扩增和扩增产物的克隆、测序,获得了中国江西土鸡IL-18基因片段,其大小为597bp,与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18的基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。

关键词: 鸡IL-18 基因, cDNA 克隆 序列测定

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2005年05月23日

【期刊论文】伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

周锐, 洪文洲, 陈焕春, 方六荣, 何启盖, 吴斌

畜牧兽医学报,2001,32(3),235~243,-0001,():

摘要

本研究从含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)Ea株gD基因BamHI 616Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段,并对上游片段进一步改造,去掉gD基因上游的非编码序列,构建了含完整gD基因编码区的重组质粒pBRgDI,并利用基因内部的限制性内切酶位点,用内切酶KpnI和SalI酶切分析,证实了gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒pSKgDSB和pSKgDS,并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较,发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变,在编码氨基酸残基水平上也有差异。

关键词: 伪狂犬病病毒, Ea株, gD基因, 克隆 序列分析

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2005年03月04日

【期刊论文】IBDV南京野毒株VP2结构蛋白基因克隆与表达*

姜平, 陈溥言, 蔡宝祥

南京农业大学学报, 1996, 19 (4): 61~65,-0001,():

摘要

用微机辅助设计合成了一对引物,用于扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)中国地方株VP2基因片段。RT2PCR扩增出-1321bp的目的片段,分子杂交鉴定为V P2基因。扩增产物经双酶切后插入含噬菌体PRPL双强启动子的pCYTEXP1表达质粒,构建了VP2基因克隆pCVP21,经Dot2ELISA筛选出4个VP2表达阳性克隆。SDS2PA GE和W estern blot显示有-约32000的目的蛋白带,且能与IBDV阳性血清结合。

关键词: 传染性法氏囊病病毒, 结构蛋白, 基因克隆 基因表达, RT 2PCR

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2005年03月04日

【期刊论文】用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在菌体表面的形态和分布

陆承平, 曾巧英,

中国农业科学, 2004, 37 (1): 143-147,-0001,():

摘要

用猪链球菌2型江苏分离株HA9801全菌免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞和Sp2/0细胞融合,以电泳纯溶菌酶释放蛋白(MRP)为抗原,间接ELISA筛选MRP抗体阳性孔并用有限稀释法单克隆化,剔除与胞壁杂蛋白交叉反应阳性的克隆,获得3株特异针对MRP的单克隆抗体细胞株3A3、4D5和6B4。将HA9801和HEp22细胞共孵育,使细菌粘附于细胞表面,用3株MRP单克隆抗体联合介导FITC标记HA9801菌体表面的MRP,激光共聚焦显微观察,代表MRP的荧光图像显示,MRP是一线形表面大分子,一端锚定在细胞壁,另一端向空中伸展,其分布状态有单在和丛集2种。

关键词: 猪链球菌2型, 溶菌酶释放蛋白, 克隆抗体, 激光共聚焦显微术

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2005年02月25日

【期刊论文】恩诺沙星单克隆抗体的制备及鉴定

曾振灵, 蔡勤仁, 杨桂香, 陈杖榴, 方炳虎

中国农业科学 2004,37(7):1060~1064,-0001,():

摘要

碳二亚胺法合成了2种恩诺沙星(enrofloxacin,ENFX)人工抗原ENFX-BSA 和ENFX-OVA,用紫外扫描和分析载体蛋白的氨基酸组成等方法对人工抗原进行鉴定,ENFX 与BSA 的结合比约为48∶1。用ENFX-BSA 免疫BALB/C 小鼠,采用显微克隆技术最终筛选出2 株特异性分泌细胞2C5 和5D5 并获取腹水,纯化后腹水效价分别为1∶3 200和1∶6 400。2C5 和5D5 均属IgG2a 型抗体。单抗5D5 间接竞争ELISA(Ci-ELISA)的工作浓度为1∶1 000,ENFX 的抑制曲线在0.13~10 000 ng·ml-1 之间线性关系良好(r =-0.9782),检测限(LOD)为0.13ng·ml-1,ENFX 的IC50为21.67ng·ml-1。单抗对氟喹诺酮类药物有很高的选择性,与环丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、达氟沙星的交叉反应率分别为110.84%、27.40%、71.05%和37.41%,而与头孢氨苄、氯霉素、磺胺间甲氧嘧啶等没有交叉反应。

关键词: 恩诺沙星, 克隆抗体, 交叉反应

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