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2009年10月24日

【期刊论文】家蝇抗菌肽Cecropin-His6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建

朱家勇, 徐建华, 朱家勇*, 金小宝, 许琴英

生物技术,2005,15(1):3~7,-0001,():

摘要

克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin-His_6融合基因,构建其真核表达载体,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA,RT-PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列,将其克隆至pUCm-T载体进行序列测定;然后用含6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin-His_6融合基因,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1(+)中;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明,RT-PCR扩增得到约230bp的目的cDNA片段,与Genebank中报道的家蝇Cecropin cDNA序列存在一个无义变异差异(Lys:AAG→AAA);6×His标签成功融合到Cecrapin的C端。Cecropin-His_6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。

关键词: 家蝇, 抗菌肽, 基因克隆 生物信息学分析, 真核表达载体

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2009年08月30日

【期刊论文】宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析

凌虹, 谷鸿喜, 张凤民, 钟照华, 王文阁, 郭淑元, 娄阁, 郭彩玲

,-0001,():

摘要

目的 人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期基因区(L1)编码病毒的主要衣壳蛋白,且HPV16感染与宫颈癌发生、发展关系密切,故对中国妇女感染的HPV16基因进行克隆及序列分析有重要实际意义。方法 采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增了3 例中国妇女宫颈癌组织中HPV16的L1基因片段,并对其进行了克隆及全序列分析。结果 发现3个HPV16L1基因核苷酸序列有4处均与最初报道的HPV16L1 DNA序列不同,并由此引起所编码的氨基酸亦发生变化。结论 中国妇女宫颈癌组织中HPV16L1核苷酸有一定程度变异。

关键词: 人乳头瘤病毒16型, L1基因克隆 核苷酸序列测定

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2009年06月09日

【期刊论文】人乳头瘤病毒16型E5转化基因的克隆及原核表达

楚雍烈, 曹春霞, 刘文康, 杨娥

细胞与分子免疫学杂志,2001,17(6):516~517,-0001,():

摘要

目的 建立人乳头瘤病毒16型E5基因的无性繁殖系为进一步研究其致癌机理作准备。方法 用PcR技术从HPVl6质粒DNA中扩增出E5基因序列连接到pGEM-T载体,将阳性的重组 DGEM-T用BamHI/ECORI双酶切并回收目的片段连接到原棱表 达载体DGEX 2T,转化DH5d菌株。取工程苗,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果 ①经PCR、测序和双酶切鉴定,认为HPVl6 E5正确插入上述表达载体,建立了该转化基因的无性繁殖 系。②经IPTG诱导的PGEX-2T-E5质粒表达出约42KD的融合蛋白,分析含有约16KDHPVl6E5蛋白,与预期含HPVl6 E5的融合蛋白分子量相符。结论 ①采用PCR克隆技术,扩增HPvl6 E5转化 基因目的片段,将其克隆到DGEM-T载体在国内首次建立了HPVl6E5转化基因的无性繁殖子。②成功构建HPVl6 E5基因的原 棱表达质粒,并表达出Gsr E5融合表达蛋白。

关键词: HPVl6, E5, 克隆,, 原棱表达

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2009年04月27日

【期刊论文】SARS冠状病毒M 基因的克隆及其表达*

江丽芳, 晏辉钧, 赵卫, 方丹云, 周经姣, 龙北国, 张文炳, 郭辉玉, 江丽芳**

中国病毒学,2005,20(1):1~4,-0001,():

摘要

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RT PCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZ-B,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P-pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut-菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物。Mut-酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约6kDa和42 kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M 蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。

关键词: SARS冠状病毒, M基因, 克隆 巴氏毕赤酵母, 表达

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2009年04月27日

【期刊论文】登革病毒2型NSI蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察

江丽芳, 高阳, 方丹云, 周俊梅

中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(10):787~791,-0001,():

摘要

目的 以登革病毒2型(dengue virus 2,DV2)结构蛋白(non-structru]protein 1,NSl)为靶基因,构建DV2-NSl的候选DNA疫苗;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用。方法将登革病毒2型NSl/NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上,构建成重组体pCXN2-NSI/NS2a。在体外将重组质粒转染Cos-7细胞,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达。大量提取空质粒和重组质粒,进行动物免疫实验。结果重组质粒可在真核细胞中有效地表达NSI蛋白。免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NSI蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫。末次免疫前已有抗体产生,4周后达高峰。抗体依赖补体介导的溶细胞作用(antibody-dependent comple-ment-mediated cytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用。淋巴细胞增殖实验结果显示,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性。流式细胞计数仪(FAcS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+、CD8+细胞水平有较大升高(P<0.01)。动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,有66.6%的免疫鼠受到保护。结论NSI/NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。这些结果为进一步研制登革病毒DNA疫苗提供了参考依据。

关键词: 登革病毒2型, NSl蛋白, 基因克隆 DNA免疫

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2009年04月27日

【期刊论文】登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

江丽芳, 高阳, 江丽芳**, 方丹云, 曾祥凤

中国病毒学,2003,18(3):201~205,-0001,():

摘要

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCxN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,l5周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1∶640:流式细胞计数仪(FAcs)检测DNA免疫鼠CD4、CD8 T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高(P<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC.I限制性杀伤性CD8 T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。

关键词: 登革病毒2型(, DV2), E蛋白, 基因克隆 DNA免疫

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2009年04月27日

【期刊论文】Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达*

江丽芳, 薛耀华, 魏惠永, 方丹云, 郭辉玉

中国人善共患病杂志,2003,19(6):31~33,-0001,():

摘要

目的 克隆2型登革病毒E基因并用酵母真核表达,获得全长的重组E蛋白,为其结构与功能的研究提供条件。方法 从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清中提取RNA,通过RT-PCR扩增E基因片段,与载体pPICZaB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P. pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut菌诱导表达,SDS-PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果 RT-PCR得到1.5kb的E基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因;Mut 酵母转化菌可分泌表达约69kDa的蛋白,与DEN2 E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论 成功将克隆的全长DEN2 E基因在酵母菌中表达,获得的重组E蛋白具有免疫反应性。

关键词: 登革病毒, E基因, 克隆 酵母菌, 表达

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2006年11月16日

【期刊论文】广州管圆线虫Y-丁基甜菜碱羟化酶基因的获得与分析*

詹希美, 孟锦绣, 梁瑜, 何蔼, 李卓雅, 雷智刚, 易冰, 张瑞琳

中国人兽共患病杂志,2004,20(3):186-189,-0001,():

摘要

目的对广州管圆线虫成虫cDNA文库的插入片段进行研究。方法铺平板培养广州管圆线虫成虫cDNA文库,从中挑选生长、分离良好的噬菌斑进行PCR扩增,根据PCR产物电泳结果挑选较大的cDNA插入片段进行克隆、测序和原核诱导表达,对表达产物进行免疫学鉴定,用生物信息学方法分析其结构和功能。结果获得了国内外尚未见报道的广州管圆线虫全长基因,该基因长1416bp,编码由421个氨基酸组成的7-丁基甜菜碱羟化酶(gsmma-butyrobetaine,2-oxoglu-tarateclioxygenase。GAMMA-BBH,EC1.14,11.1);免疫学鉴定结果显示GAMMA-BBH不能与大鼠的抗血清结合。结论首次获得广州管圆线虫成虫GAMMA~BBH表达基因,为广州管圆线虫的研究提供实验室依据。

关键词: 广州管圆线虫, eDNA文库, 克隆 7-丁基甜菜碱羟化酶, 生物信息学

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2006年11月16日

【期刊论文】日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建*

詹希美, 易冰, 何蔼, 雷智刚, 郑小英, 张瑞林, 孟锦绣, 中川军, 李卓雅

中国人兽共患病杂志,2004,20(5):390-393,-0001,():

摘要

目的扩增SjCL2基因,构建巴氏毕赤酵母表达载体pPICZB-SjCL2,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法运用RT-PCR技术,从日本血吸虫(中国大陆株)成虫总RNA中扩增获得SCL2基因;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB质粒;经KpnI、xbaI双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序分析SCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果利用RT—PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约1Kb大小的S]CL2基因,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB中。结论成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB-CL2质粒。

关键词: 日本血吸虫, 组织蛋白酶L2, 基因克隆 巴氏毕赤酵母表达载体

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2006年11月16日

【期刊论文】日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的编码区全序列分析及克隆

詹希美, 雷智刚, 孟锦绣, 何蔼, 李卓雅, 易冰

中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20(6):325-327,-0001,():

摘要

目的分析日本血吸虫组织蛋白酶LI(SjCL1)基因编码区的完整序列,并定向克隆到真核表达质粒pcD。NA3中。方法从日本血吸虫成虫提取总RNA,进行反向巢式RT-PCR,T载体克隆后测序。PCR扩增SjCL1基因的编码区序列,并将扩增产物克隆到pcDNA3质粒的BamHI和XhoI位点上。结果通过反向巢式RT-PCR扩增出332bpSjCL1基因5端序列,测序后与报道的SjCL1基因部分序列拼接,可得到一个编码317个氨基酸的完整编码区序列。PCR特异性扩增出SjCL1编码区基因序列,其大小约为1kb。经酶切、PCR鉴定和测序表明所构建的质粒pcDNh-SiCL1中含有所扩增的基因序列。结论构建了含SjCL1基因的编码区序列的真核表达质粒pcDNA。SjCL1。

关键词: RT-I, 日本血吸虫, 组织蛋白酶L, 基因克隆

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2006年11月16日

【期刊论文】刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的克隆与表达*

詹希美, 余南, 何蔼, 郑小英, 申川军, 郑斌, 郑焕钦, 李卓雅, 曹爱莲

中国人兽共患病杂志,2005,21(4):331~334,-0001,():

摘要

目的克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体DET—MMIC3,并在大肠杆菌BL21株中表达。方法采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载体上,经测序鉴定后,将目的基因亚克隆到表达载体pEZ3Oa(+)上,构建质粒pETMMIC3。表达产物用Westemblot进行进一步确认。结果经初步菌液PCR鉴定,提取质粒双酶切鉴定并测序,确认插入T载体的序列为所需的目的序列;亚克隆构建pET-MMIC3,转化到宿主菌大肠杆菌BL21,得到分子量为37.2kDa的重组表达蛋白。westemblot的结果与预测相符。结论成功的克隆并融合表达了刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽,为进一步研究其在弓形虫粘附和入侵中的作用奠定了基础。

关键词: 刚地弓形虫, 微线体, 克隆 表达

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2006年11月16日

【期刊论文】刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析*

詹希美, 申川军, 何蔼, 郑小英, 余南, 郑斌, 郑焕钦, 李卓雅, 曹爱莲, 詹希美**

中国人兽共患病杂志,2005,21(6):461~466,-0001,():

摘要

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列,并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析。方法将NCBIGenBank中登录的弓形虫MDHEST序列进行比对、拼接和电子延伸,发现近5’末端的部分核酸序列缺失。基于分析,设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA-UGA),使经RT.PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF。之后对MDHCDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析。结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp,推导翻译出的蛋白质有316个aa组成,约35kDa,与预期大小接近。保守功能域分析表明。弓形虫MDH最接近类一乳酸脱氢酶型(1actatedehydrogenase-like)MDH,其准确定名缩写为LDH-likeMDH,同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征。弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外,还与很多细菌等物种同源,但与人的同源性最低(22%)。弓形虫MDHcDNA序列在NCBIGenBank中登录号为AY650028,对应aa序列的登录号为AAT67462。结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列。MDH是三羧酸循环中的重要酶类。该酶活性的改变。将直接影响弓形虫的存活。弓形虫MDHaa序列与人MDH蛋白问的同源性很低,提示基于MDH蛋白作为药靶,经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性。

关键词: 弓形虫, 苹果酸脱氢酶, 克隆 序列分析

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2006年11月16日

【期刊论文】日本血吸虫组织蛋白酶L2基因扩增及克隆*

詹希美, 雷智刚, 何蔼, 李卓雅, 孟锦绣, 易冰

中国人兽共患病杂志,2003,19(6):34-37,-0001,():

摘要

目的体外扩增日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L2(SjeL2)的编码区基因序列,将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中,为进一步对其进行功能研究奠定基础。方法用TRIZOL分离日本血吸虫成虫RNA,RT-PCR扩增目的基因。将扩增产物定向克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果RT-PCR特异性扩增出S)CL2编码区基因序列。其片段大小为lkb左右,经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pcDNA一CL2中含有所扩增的基因序列。结论RT-PCR扩增的SCL2编码区基因序列与预期长度相符合,成功构建了含CL2编码区基因的真核表达质粒pcDNA-SfCL2。

关键词: 日本血吸虫, 组织蛋白酶, RT-PCR, 基因克隆

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2006年11月01日

【期刊论文】华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析*

余新炳, 何东苟, 余新炳*, *, 吴忠道, 徐劲, 吴德, 胡旭初, 陈守义

中国寄生虫病防治杂志,2004,17(2):96~99,-0001,():

摘要

目的筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶(csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3上,为进一步研究其功能奠定基础。方法对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用Motif-san、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析。根据PGEX-4T-1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的sLysoPLAHcDNA编码序列设计引物,进行PcR扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3上。构建的PGEX-4T-1-csLysoPLAH、pcDNA3-csLysoPLAH重组表达质粒经PcR、双酶切及测序证实。结果发现sLysoPLAH基因,完整阅读框含708个碱基,编码235个氨基酸,理论分子质量为25.2628ku,理论pI为6.03。序列分析表明,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,csLysoPLAH具有磷脂酶/羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽(即GxsxG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。结论发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因,并成功构建原核和真核重组表达质粒。

关键词: 华支睾吸虫, 溶血磷脂酶, 克隆 序列分析

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2006年11月01日

【期刊论文】华支睾吸虫卵黄前体蛋白B基因的识别、序列分析和克隆表达

余新炳, 黄艳, 吴忠道, 吴德, 胡旭初, *

寄生虫与医学昆虫学报,2005,12(1):20~24,-0001,():

摘要

为识别和克隆华支睾吸虫新基因,对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,并利用在线生物信息学工具进行序列分析,识别华支睾吸虫未知基因,同时根据PGEX-4T-1多克隆位点及未知基因的序列设计引物,PCR扩增目的基因,并构建原核重组质粒。结果发现了CsvpB基因,其完整阅读框含762个碱基,编码254个氨基酸,理论分子量为27.7kDa。序列分析表明,CsvpB蛋白与其它物种的卵黄前体蛋白有较高的同源性,所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-vpB经PcR、双酶切及测序证实与目标基因相符。

关键词: 华支睾吸虫, 卵黄前体蛋白B基因, 序列分析, 克隆

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2006年11月01日

【期刊论文】华支睾吸虫成虫转录辅激活因子基因在原核细胞中的克隆、表达及其生物功能分析

余新炳, 张咏莉, 余新炳*, 吴德, 吴忠道, 毕惠祥

中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23(1):18~23,-0001,():

摘要

目的构建华支睾吸虫成虫转录辅激活因子(transcriptionalcoactivator,Tc)基因(TC基因)原核重组质粒,进行原核表达、鉴定及生物功能分析:方法根据TC基因已知序列设计1对引物,从华支睾吸虫成虫cDNA文库中扩增TC基因片段;将目的基因进行聚合酶链反应(NR),其产物和空质粒pGEX-4T-1.pET30a(+)同时用限制性内切酶BamHJ、SalI双酶切,纯化回收后连接并转化大肠埃希菌(E.coliBL21)将构建的重组质粒pGEX-4T-1-TC和pET30a(+)-TC分别经双酶切、PCR及测序鉴定后在大肠埃希菌BL21中诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹祛(Westemblotting)鉴定其表达效果。用亲和层析法纯化重组质粒pET30a(+)-TC表达产生的组氨酸重组蛋白(His-TC)结果构建了TC基因原核重组质粒pGEX-4T-1-TC和pFT30a(+)-Tc0sPS-PAGE结果表明TC基因在大肠埃希菌BL2l系统获得高效表达,其重组蛋白分子量与理论值相符:Westemblotting结果表明重组质粒pGEX-4T-1-TC表达的谷胱甘肽硫转移酶(GST)重组蛋白(GST-TC)可被华支睾吸虫免疫兔血清识别,具有免疫反应性。纯化的TC基因的组氨酸(His)重组蛋白(His-TC)经sDSPAGE显示单一条带:结论通过生物信息学方法由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出TC基因,并成功予以克隆、表达及纯化。

关键词: 华支睾吸虫, 转录辅激活因子基因, 基因重组, 基因克隆 原核表达

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2006年11月01日

【期刊论文】华支睾吸虫表膜相关蛋白基因的扩增、序列分析和克隆*

余新炳, 黄艳, 徐劲, 吴德, 胡旭初, 王海, 吴忠道

中国人兽共患病杂志,2005,21(12):1064~1067,-0001,():

摘要

目的识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白(tegumentalproteinofClonorchissinensis,CsTP)的cDNA序列克隆到原核载体中,为进一步的研究奠定基础。方法对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,用在线生物信息学工具进行序列分析,识别CsTP基因,并对其进行同源性、物理性质及结构分析。设计引物,从华支睾cD-NA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,并构建原核重组质粒,相同引物从华支睾吸虫基因组中扩增出CsTP的DNA序列。结果发现CsTP基因,其cDNA完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.7kDa;其DNA序列含1393个碱基,含有3个外显子、2个内含子。序列分析表明,CsTP蛋白与其它物种的表皮蛋白或膜相关蛋白有一定的同源性。所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-CsTP经PCR、双酶切及测序证实与目的基因相符。结论发现华支睾吸虫表膜相关蛋白基因,成功构建其重组原核表达质粒为进一步研究该基因的功能提供了条件。

关键词: 华支睾吸虫, 表膜相关蛋白基因, 序列分析, 克隆

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2005年03月08日

【期刊论文】旋毛虫抗原基因Ts88的克隆及鉴定*

诸欣平, 杨雅平, 杨静, 雷丽萍, Pascal Boireau

中国人兽共患病杂志,2004,20(1):19~21,-0001,():

摘要

目的 获取旋毛虫具有抗原性的新基因。方法 应用旋毛虫免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库约3×105重组噬菌斑进行筛选。基因克隆、DNA测序及5’-RACE 获cDNA全长;采用ESEE、DNAstar软件及核苷酸序列数据库(GenBank)进行cDNA序列分析。结果 与结论免疫筛选成虫cDNA文库,获得3个阳性克隆。其中的Ts88克隆cDNA全长为1966bp,编码484个氨基酸,含有一个PWWP功能结构域及多个抗原表位。Ts88cDNA是一个尚未见报道的旋毛虫抗原新基因。

关键词: 旋毛虫, cDNA文库, 基因克隆 筛选, cDNA末端快速扩增

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2005年03月08日

【期刊论文】免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达★

诸欣平, 杨静, 诸欣平**, 杨雅平, 周蕾, PascalBoireau, 詹斌, 冯建军, Hotez Peter

中国寄生虫病防防治杂志,2003,1(16):7~9,-0001,():

摘要

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入PET228a(+)表达载体,IPTG诱导表达后用SDS2PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87;成功构建重组表达质粒PET228a(+)/Ts87。诱导表达该融合蛋白,SDS2PAGE电泳表明,其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白,与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。

关键词: 旋毛虫, 免疫筛选, cDNA克隆 原核表达

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2005年03月08日

【期刊论文】抗旋毛虫成虫单克隆抗体的制备和保护性免疫的初步研究

诸欣平, 高欣, 黄敏君, 郭增柱, 周蕾, 姜洪杰

中华传染病杂志,2002,5(20):297~300,-0001,():

摘要

目的 获得抗旋毛虫成虫的单克隆抗体(单抗)并初步研究其保护性免疫作用。方法 利用杂交瘤技术,用旋毛虫成虫抗原免疫的Balb/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。用免疫双扩散鉴定单抗亚类,免疫印迹鉴定单抗的特异性。小鼠尾静脉接种单抗进行被动免疫保护实验。结果 建立了1株稳定分泌抗旋毛虫成虫单抗的细胞株。杂交瘤细胞培养上清液效价为1:6400,诱生腹水ELISA效价达1:204800。经鉴定单克隆抗体类型为IgM,可以识别旋毛虫成虫、肌幼虫及新生幼虫,相对分子质量约为40000蛋白,并且不与猪蛔虫、血吸虫、包虫、囊虫抗原发生交叉反应。单抗被动免疫后的减虫率为55.63%。结论 获得1株具种特异性、保护性的单克隆抗体,为筛选能诱导保护性免疫功能的旋毛虫抗原分子提供了有力的工具。

关键词: 旋毛虫, 成虫, 抗体,, 克隆

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