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2007年05月31日

【期刊论文】人N-甲基-D-门冬氨酸受体主亚基受体激活相关多肽的理化特性与抗原性分析

孙长凯, 赵杰, 李伍举, 冯健男, 刘淑红, 朱克, 王吉庆, 尹安民, 韩大跃, 张万琴, 姜潮, 姜长斌, 聂志余, 王耀山, 包礼平, 范明

中华医学杂志2002年1月10日第82卷第1期/Natl Med J China, January 10, 2002, Vol. 82, No. 1,-0001,():

摘要

目的 分析人N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR)主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽P1、P2的抗原性及其理化特性。方法 用GOLDKEY软件从蛋白质数据库中调出人NR1a分子的氨基酸序列,分别在其第一、第三跨膜域前后逆向、顺向截取151和144个氨基酸长度的多肽片段P1与P2,选取Hopp&Woods与Kyte亲水性、Janin表面可及性、Karplus-Schulz主链柔韧性及Welling抗原性等参数予以多参数分析,采用Prosite程序与Chou-Fasman方法比较其氨基酸位点与二级结构特征,以此为基础综合判定P1与P2片段的抗原位点并与已有的实验结果相比较。结果 P1、P2多肽片段上可能分别有6和7个8~15aa长序列具有良好的抗原性。P1相关序列主要分布于其氨基端,与配体结合关键氨基酸残基相距较远。P2上的相关序列分布较均匀,包含有受体激活重要相关位点或与配体结合关键氨基酸残基距离较近。P2片段的总体抗原性、亲水性与可及性均强于P1,尤以其近膜的15个残基为著。P1、P2多肽片段均含有一定数量的β-转角,但P1片段含有较多的半胱氨酸残基和无规卷曲,而P2片段则含有较多的芳香族残基并以α螺旋结构为主。结论 人NMDAR主亚基NR1a上的两个受体激活相关多肽P1、P2均具有一定数量的抗原位点,与P1相比较,P2可能更易成为NMDAR免疫干预的分子靶点。

关键词: 神经免疫调节, 受体 抗原, 氨基酸类

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2007年05月31日

【期刊论文】N-甲基-D-门冬氨酸受体主亚基单克隆抗体抗谷氨酸兴奋毒性的体外实验研究

孙长凯, 康晓楠, 范明, 丁爱石, 赵杰, 王吉庆, 韩大跃, 施广霞

中华医学杂志2003年9月25日第83卷第18期/Natl Med J China, September 25, 2003, Vol. 83, No. 18,-0001,():

摘要

目的 研究人N-甲基-D-2门冬氨酸受体(NMDAR, NR)主亚基(NR1)单克隆抗体mAbN1是否对兴奋毒性脑损害有防护作用。方法 取10只新生大鼠海马神经细胞进行体外原代培养,建立了谷氨酸对培养海马神经细胞兴奋毒性神经损伤模型,观察抗体保护后神经细胞形态,检测细胞存活率(锥虫蓝拒染法)和细胞培养上清乳酸脱氢酶漏出量,每组2个平行皿,实验重复4次。结果 经0. 3μmol/ L mAbN1预处理后,神经元具有明显抗谷氨酸兴奋毒性损伤能力,存活率提高35 %;抗体表位合成肽可以阻断这种保护,提示该抗体的保护功能是特异性的。结论 NR1单克隆抗体mAbN1具有体外抗兴奋毒作用,该研究为兴奋毒性脑损害抗体治疗提供了重要依据。

关键词: 受体 N-甲基-D-天冬氨酸, 兴奋性氨基酸类, 细胞培养, 治疗

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2007年05月31日

【期刊论文】噬菌体肽库中筛选NMDA受体抗原表位

孙长凯, 康晓楠, 范明, 薛沿宁, 邵宁生, 赵杰, 韩大跃, 施广霞

生物化学与生物物理进展/Prog. Biochem. Biophys. 2003;30 (4),-0001,():

摘要

为了获得人N-甲基-天冬氨酸受体(NR)主亚基(NR1)M3-M4环B细胞表位,以人NR1分子M3-M4环单克隆抗体MAB363淘筛噬菌体展示随机12肽库,对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析。从30个克隆中得到一个阳性克隆序列“VHTNPSTWQPIL”(克隆1),原核表达的NR1 M3-M4环可以与克隆1竞争结合MAB363。固相合成5个表位探针短肽,发现其中只有R(22)LRNPSKD可以与M3-M4环竞争结合抗体,将NPS三个氨基酸残基逐一敲除,缺失N或NP的合成肽和M3-M4环竞争抗体的能力减弱,缺失NPS的合成肽完全没有竞争能力,证明MAB363的表位为NPS,S可能是关键性残基。上述结论为免疫干预防治兴奋毒性脑损害策略的实施提供了一个重要线索和依据。

关键词: 噬菌体展示, B细胞表位, NMDA受体

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2007年05月31日

【期刊论文】N-甲基-D-门冬氨酸受体重组肽抗血清对谷氨酸兴奋毒性导致神经元坏死和凋亡的保护作用

孙长凯, 康晓楠, 朱克, 范明, 丁爱石, 马清钧, 石成华, 赵杰, 韩大跃, 王耀山, 施广霞, 包礼平

中华神经科杂志2003年10月第36卷第5期/Chin J Neurol, October 2003, Vol. 36, No. 5,-0001,():

摘要

目的 观察N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR, NR)主亚基(NR1)M3M4环重组肽自身抗血清对不同浓度谷氨酸诱导的神经元死亡的保护作用。方法 用NR1 M3M4环重组肽免疫Balb/C(H-2d)小鼠制备抗血清,用锥虫蓝染色法和原位末端标记(TUNEL)法观察抗血清对原代培养海马神经元兴奋毒性坏死和凋亡的保护效应。结果 在高浓度谷氨酸(500 μmol/L)条件下,阳性抗血清可以使神经元坏死减少16%; 在低浓度谷氨酸(50 μmol/L)作用下,阳性抗血清保护可使神经元凋亡率减少13%。结论 NMDAR重组肽自身免疫抗血清具有抗兴奋毒性作用,这一结论为免疫防治兴奋毒性脑损伤策略的建立提供了坚实的体外基础。

关键词: 受体 N-甲基-D-天冬氨酸, 肽类, 谷氨酸, 自身免疫, 神经元, 细胞凋亡

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2007年05月31日

【期刊论文】人NMDA受体主亚基M3-M4环基因片段的高效表达、纯化与鉴定

孙长凯, 张玉梅, 范明, 李伍举, 刘淑红, 赵杰, 韩大跃, 王嘉玺

中国生物化学与分子生物学报2003年10月19(5): 588-593/Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,-0001,():

摘要

用基因工程方法获得人N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体主亚基M3-M4环靶片段,以此为免疫原,用于进一步免疫原性及相关应用研究。自人脑胶质瘤组织中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出人NMDA受体主亚基M3-M4环的基因片段,并按照计算机辅助原核表达载体pBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法,将其进行优化改构。将目的基因克隆到pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,升温诱导表达,从蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况,通过制备性SDS-PAGE进行纯化,从相对分子质量、免疫反应性、肽质谱指纹分析等方面进行鉴定。结果表明,成功构建了人NMDA受体主亚基M3-M4环的原核表达载体(命名为pBV-NR1L3),通过基因优化,实现了高效表达。凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白29%,重组肽纯度达95%以上。

关键词: 人N-甲基-D-天冬氨酸受体 原核表达, 纯化与鉴定

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