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2006年11月02日

【期刊论文】RNA干扰技术抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的初步研究

葛坚, 黄圣松, 王莉娜, 尹心宝, 魏雁涛, 马萍

中华眼科杂志,2005,41(12):1076~1081,-0001,():

摘要

目的探讨RNA干扰技术对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的抑制作用。方法采用化学合成的靶向IKK2β的siRNA,转染体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞,同时以对任何基因均无作用的siRNA作为阴性对照。以逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)技术检测IKK2βmRNA表达水平,免疫印迹法检测IKK2β蛋白表达水平。将siRNA的转染浓度分别设为5、10、25、50、100、200nmol/L,进行转染,于转染后48h采用四甲基偶氮唑盐法检测其转染后对成纤维细胞的抑制作用。结果 经转染了靶向IKK2β的siRNA,其成纤维细胞IKK2β的mRNA和蛋白表达水平均受到抑制。各个转染浓度(5、10、25、50、100、200nmol/L)均可抑制成纤维细胞的增殖(P<0.05),抑制率分别为10.72%、23.35%、30.84%、51.25%、50.06%、49.63%,50nmol/L时已达最大抑制率。结论靶向IKK2β的siRNA转染可以降低IKK2β的表达水平,同时对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖具有抑制作用。抗IKK2β的RNA干扰技术可能是抑制抗青光眼术后滤过道瘢痕化的新手段。

关键词: RNA干扰,  蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶,  筋膜,  成纤维细胞  细胞分裂,  青光眼

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2006年11月02日

【期刊论文】单纯疱疹病毒胸腺激酶基因系统抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的研究

葛坚, 王继兵, 刘炳乾, 黄冰, 魏雁涛

中华眼科杂志,2006,42(3):212~217,-0001,():

摘要

目的研究单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-tk)基因系统对人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTFs)增殖的抑制作用及其作用机制。方法 构建含HSV2tk基因的逆转录病毒载体pL(tk)SN并转入包装细胞系PT67进行病毒包装,G418筛选抗性克隆并扩大培养收集病毒上清,测定病毒滴度。透射电镜观察鉴定病毒颗粒;聚合酶链反应(PCR)技术鉴定tk基因在病毒基因组中的整合。用病毒感染HTFs细胞,G418筛选并扩大培养,逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)技术和免疫印迹法检测tk基因的表达;加不同浓度前药更昔洛韦(GCV)后,以MTT法检测tk基因对HTFs细胞增殖的抑制作用;采用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测凋亡细胞;电镜观察细胞形态学改变。结果酶切鉴定结果显示成功构建了逆转录病毒载体pL(tk)SN,电镜下包装细胞产生的病毒颗粒呈椭圆形,直径约100nm;病毒基因组中,PCR扩增出了tk基因;测得病毒滴度为4×107cfu/ml;被转染的HTFs细胞,用RT2PCR及免疫印迹法检测到tk基因在mRNA与蛋白水平均有表达;HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞增殖的抑制作用表现为剂量依赖性,5×10-3g/L的GCV作用5d可将细胞全部杀死,IC50为6×10-4g/L,HSV2tk2GCV系统对HTFs细胞的杀伤机制表现为坏死与凋亡,凋亡率随GCV浓度的升高而增加。结论 HSV2tk基因系统能有效抑制人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖,作用机制表现为细胞的坏死与凋亡。(中华眼科杂志,2006,42:2122217)

关键词: 单纯疱疹病毒属,  胸苷激酶,  更昔洛韦,  眼,  成纤维细胞

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