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2005年03月16日

【期刊论文】永生化人晶状体上皮细胞细胞周期调控相关基因表达的检测

曾骏文, 吴明星, 李绍珍, 高劲松, 刘奕志

中华眼科杂志,2002,38(6):367-372,-0001,():

摘要

目的 探讨人类晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)周期调控中的细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白激酶(cyclin dependent kinase 2,CDK2)和细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclindependent2kinase inhibitor,CKI) p21基因的表达,阐明HLEC增殖和晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)的分子机制。方法 体外培养永生化HLEC系HLE-B3,用二步过量胸苷阻断法进行细胞周期同步化;流式细胞仪检测细胞周期;收集不同时相的细胞提取总RNA。用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测细胞周期蛋白E、CDK2和p21的mRNA表达;分别用免疫组织化学染色和Western blot法检测细胞周期蛋白E和CDK2及p21的蛋白表达。结果 流式细胞仪检测:HLE-B3细胞周期处于G1期,占33.5%;S期,占46.1%;G2期,占20.4%;处于S期及G2期细胞的比例约占总数的66.5%。RT-PCR检测:可见不同周期时相的HLE-B3细胞(细胞周期蛋白E和CDK2)mRNA的表达,但在不同步化的细胞时相中未检测出细胞周期蛋白E的表达。而在同步化的S期细胞中有少许p21mRNA表达。免疫组织化学染色未检测出细胞周期蛋白E阳性细胞,仅可检测出少部分p21阳性细胞。Western blot法检测结果:CDK2阳性表达以S期细胞明显,G1期和G2期略低于S期表达。不同步化细胞也有CDK2的表达。提示细胞周期蛋白E、CDK2与p21的mRNA蛋白表达不平衡。结论体外培养HLE-B3细胞周期过程中存在细胞周期蛋白E、CDK2和p21的表达,且存在表达不平衡。细胞周期蛋白E、CDK和CKI间的表达不平衡有可能是其体外增殖细胞周期分子机制之一。

关键词: 晶体, 上皮细胞, 细胞培养, 细胞周期蛋白E, 细胞周期蛋白质依赖激酶类

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2005年03月16日

【期刊论文】外源性细胞周期蛋白激酶抑制因子p21基因对人晶状体上皮细胞周期的影响

曾骏文, 吴明星, 李绍珍, 刘奕志

中华眼科杂志,2003,39(4):209-214,-0001,():

摘要

目的 研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21基因转染对人晶状体上皮细胞(lensepithelial cells,LEC)周期调控的影响,在基因水平探讨防治后发性白内障的可能性。方法 构建含人p21基因真核表达的载体质粒pcDNA3/p21,采用基因转染技术将质粒DNA转染至永生性人LEC系HLE2B3,使用流式细胞仪观察细胞生长和周期的变化,并采用逆转录聚合酶链式反应方法检测p21mRNA的表达;分别采用免疫组化和免疫印迹(western blotting,WB)方法检测p21蛋白的表达。结果 体外构建的载体质粒pcDNA3/p21经酶切鉴定含有人p21基因全长cDNA片段。基因转染后细胞HLE-B3,经传代培养,48h后出现缓慢生长且部分细胞漂浮死亡的现象,G1期细胞明显增多。与对照细胞比较,转染后细胞的p21mRNA表达明显增多;p21蛋白表达明显增强,在经筛选的阳性克隆细胞中WB方法可检测到相对分子质量为21000的阳性蛋白带。结论 外源性p21基因可在人LEC系HLE2B3中过度表达,并对细胞周期调控产生抑制作用。基因转染抑制LEC增殖可能成为防治后发性白内障的新途径。

关键词: 细胞周期 细胞周期蛋白类, 转染, 上皮细胞, 晶体

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