【目的】探讨兔关节软骨细胞的分离、培养方法，观察单层高浓度培养时细胞表型表达情况。【方法】无菌条件下，从2周龄新西兰白兔的颞颌关节及四肢关节髁突面削取软骨片，采用机械-酶消化法分离软骨细胞，经台盼蓝拒染计数，将细胞按l×106个/孔接种于6孔培养板，传代培养，描绘生长曲线。利用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态。应用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定。【结果】每克软骨能获取1.5×106个软骨细胞，活性率为95%。培养2～3d，细胞贴壁、变形，呈多角形；8d左右，细胞融合成层。透射电镜观察显示细胞核圆形，有丰富的粗面内质网、高尔基体及分泌的基质成分。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。细胞传至5代后，出现“成纤维细胞样”。【结论】本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代细胞生长良好，适合于实验研究；软骨细胞5代培养后，细胞表型发生改变。