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2006年11月01日

【期刊论文】C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系的建株

余新炳, ZHANG Jia-qing, YU Wei-hua, ZHANG Xiu-ming, PENG Yan-wen, LI Wei-qiang, CHEN Rui, YU Xin-bing, LI Shu-nong, XIANG Peng△

chinese Journal of Pathophysiology 2006, 22(1): 7-11,-0001,():

摘要

目的:建立C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系。方法:收集3.5d.P.c.的囊胚,培养在预先铺有小鼠成纤维细胞(MEFs)的高糖DMEM培养液中。3-4d后,挑出内细胞团(ICM),消化后重新种到新鲜的有MEFS培养液中。等到有典型的ES样集落长出,即传代以得到永久ES细胞系。通过分析碱性磷酸酶活性,SSEA-1,Oct-4的表达和形成畸胎瘤的能力来鉴定ES细胞的多向分化能力。结果:获得的两个C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系绝大多数细胞具有正常的核型(40,XY),碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-l,Oct-4表达阳性,ES细胞注入SCID鼠后可获得来自3个胚层的组织。结论:建立了两株具有长期自我更新能力和多向分化潜能的C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系。

关键词: 小鼠, 胚胎干细胞, 杂交

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2006年10月21日

【期刊论文】杂色鲍的胚胎发育*

吕军仪, 陈志胜, 吴金英, 曾华, 苏冠华

动物学报,2001,47(3):317~323,-0001,():

摘要

杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)的胚胎发育分为4个阶段共32个发育期,其中,卵裂阶段有13个时期:受精期、第1极体放出期、第2极体放出期、2细胞分裂早期、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、128细胞期、桑椹期和囊胚期。胚胎发育阶段有4个时期:原肠期、担轮幼体早期、担轮幼体晚期和担轮幼体孵化瞬期。胚后发育阶段有13个时期:担轮幼体期、面盘幼虫早期、面盘幼体中期、面盘幼体后期、匍匐幼体早期、匍匐幼体中期、匍匐幼体后期、围口壳幼体早期、围口壳幼体中期、围口壳幼体后期、上足分化幼体早期、上足分化幼体中期和上足分化幼体后期。幼鲍阶段有2个时期:第1呼吸孔出现早期,第1呼吸孔出现期。在适宜水温范围内,随着水温升高,孵化期相应缩短。在水温18~34℃条件下,受精卵不同程度都能孵化,但孵化率和孵化时间则有很大差别。在水温18℃时,鲍卵从受精至开始孵化需经历11hr32min,孵化率占215%,平均孵化期为26hr15min,孵化速率为010381,周限增长率为110010/hr;而在水温22℃条件下,经过7hr30min才开始孵化,平均孵化期为23hr5min,孵化速率为010415,周限增长率为110202/hr。鲍卵受精后,在水温为2317~2815℃、盐度为3218%~3415%(比重110223~110229)的条件下,只需经23~24d就能发育为幼鲍(为第一个呼吸孔出现期)。

关键词: 杂色鲍, 胚胎发育, 水温

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2006年11月03日

【期刊论文】体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究*

葛坚, 陶靖, 葛坚△, 黄冰, 王智崇, 郭彦, 余克明, 陈慧怡, 陈系古

中国病理生理杂志,2003,19 (3): 289-292,-0001,():

摘要

目的:探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性。方法:ESCs经胚胎体阶段,以视黄酸及视网膜müller细胞诱导,在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增7d,观察形态变化,采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物,并对其扩增及分化能力进行观察。结果:ESCs经初级诱导,NSCs选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性,整合BrdU,表达nestin、glutaminase、Brn-3基因,且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论:视黄酸及müller细胞诱导的ESCs,经选择性培养基筛选培养可获得NSCs,有望为青光眼等神经变性疾病提供新的治疗途径。

关键词: 胚胎干细胞, 神经再生, 小鼠

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2006年11月02日

【期刊论文】蛋白激酶Cα 在小鼠胚胎干细胞定向分化中对发育基因表达的调控作用

葛坚, 高前应, 王智崇, 陈慧怡, 黄丹平, 袁钊辉

中华眼科杂志,2005,41(2):123~127,-0001,():

摘要

目的探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对小鼠胚胎干细胞(ESCs)定向诱导分化中发育基因(pax26、slit22、netrin21)表达的影响。方法ES2BALB/c细胞株用无白血病抑制因子(mLIF)的ESCs培养液培养4d,形成胚胎体(EBs),再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,经5×10-7mol/L视黄酸(RA)诱导后,用神经细胞特异性抗原NSE和NF2200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后1、3、5、7及14d用逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)方法测定细胞的PKCα和发育基因的mRNA表达情况,并观察了PKC激活剂佛波酯(PMA)和PKC抑制剂D2鞘氨醇对它们表达的影响。结果 免疫组化发现在诱导后第3d大多数细胞NSE和NF2200染色阳性,RT2PCR证实诱导后1dPKCα、pax26和netrin21的mRNA表达急剧下降,3~7d逐渐升高,至14d恢复至正常水平,而slit22在诱导前后均无明显表达。PMA可使PKCα、pax26、netrin21的mRNA水平在诱导后细胞中的表达明显增强,而D2鞘氨醇的作用相反,使它们的表达显著降低,而对slit22无明显影响。结论发育基因pax26和netrin21在ESCs定向分化为神经样细胞中有重要的调控作用,可能是通过PKCα信号通路起作用。

关键词: 胚胎;  干细胞;  蛋白激酶C;  细胞分化;  基因表达调控, 发育期;  小鼠

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2006年11月02日

【期刊论文】SD 大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

葛坚, 杨智宽, 郭彦, 王智崇, 刘海泉

中华眼底病杂志,2002,18(2):134~136,-0001,():

摘要

目的探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)体外分化的诱导作用。方法收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液,抽滤后按2:3比例与DMEM培养液混合,用该混合液进行ES细胞的诱导分化,每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilamentprotein,NFP)免疫组织化学检查。结果加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构,NFP免疫组织化学染色阳性。结论SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。

关键词: 胚胎诱导,  细胞分化,  神经元,  干细胞,  动物实验替代试验

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2006年01月11日

【期刊论文】体外定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

黄绍良, SA Ya-lian, LI Hai-biao, HUANG Shao-liang

[J SUN Yan-sen Univ (Med sci). 2003, 24 (2): 97-99, 103],-0001,():

摘要

[目的]探索体外定向诱导人胚胎干细胞(hEs细胞)分化为表皮样干细胞的条件。为研究其定向分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。[方法]将人胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜上皮面向上全铺或半铺布半孔底共培养4~5d。观察其形态变化井分别用β1整合素,CKl5及CKl9免疫组化检测人胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。[结果]人胚胎干细胞与人羊膜共培养4~5d后,在人羊膜上皮面形成表皮样干细胞集落,表达高水平的表皮干细胞特异标记物β1整合素、CKl5和CKl9。在无羊膜覆盖处。细胞贴壁生长,形成单层表皮样细胞,细胞呈多边形。排列紧密。大部分细胞表达β1整合素。对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞。[结论]在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞,并提示在羊膜上皮面的细胞克隆可能是表皮样干细胞,而贴壁生长的细胞可能大部分是表皮样瞬间放大细胞。

关键词: 人, 胚胎干细胞, 表皮干细胞, 分化, 羊膜, 免疫组织化学

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2006年01月11日

【期刊论文】 定向诱导小鼠ES细胞为肝脏细胞及其凝血因子Ⅷ, Ⅸ的表达*

黄绍良

中国科学C辑生命科学,2005,35(3):269-274,-0001,():

摘要

凝血因子vⅢIX缺陷导致血友病A和B的发生、肝细胞是产生凝血因子的器官,利用肝细胞进行替代治疗是纠正凝血因子缺陷的根本办法,但是其来源及利用存在难以克服的问题Es细胞具有体外培养时保持未分化状态和无限的增殖能力,具有在一定条件下可以分化发育成各个胚层细胞的潜能,利用Es细胞源性肝细胞作为供体细胞,解决了肝细胞来源困难、增殖能力差的难题体外分阶段定向诱导E14小鼠Es细胞分化为肝细胞,ICG摄取及PAs反应结果证实Es源性细胞具备肝细胞功能,在此基础上,利用RT-PCR法对诱导细胞初步进行了凝血因子VⅢIX表达分析,为进一步开展利用Es细胞纠正凝血因子缺乏奠定了研究基础。

关键词: 胚胎干细胞, 分化, 肝细胞, 凝血因子

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2006年01月10日

【期刊论文】用胚胎干细胞诱导的造血干/祖细胞重建小鼠造血功能研究

黄绍良, ZHOU Qi-feng, HE Zhi-xu, FENG Lian-qiang, HUANG Shao-liang, LI Shu-nong

热带医学杂志,2003,3(1):9~11,-0001,():

摘要

目的 胚胎干细胞体外诱导分化出CD34+造血干/祖细胞,然后将其注射人致死量照射小鼠体内,以研究其重建造血功能。方法胚胎干细胞自由分化形成胚胎体后,加人造血刺激因子混台液以诱导产生CD34+造血干/祖细胞,将这些造血干/祖细胞注射人经致死剂量照射的小鼠,观察小鼠存活率的改变,并取存活2个月的小鼠骨髓和脾脏,PCR检测嵌台体形成。结果 体外分化第13日CD34+造血干/祖细胞比倒可高达17.36%,将这些细胞注射人致死量照射小鼠后,可提高存活率达86.67%,存活小鼠的骨髓和脾脏均检测到供体来源的细胞。结论 胚胎干细胞体外分化获得CD34+造血干/祖细胞,且后者具有其相应的正常生物学功能。

关键词: 胚胎 干细胞, 造血干细胞

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2006年01月11日

【期刊论文】体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为造血干/祖细胞方法的初步研究*

黄绍良, HE Zhi-xu, HUANG Shao-liang, ZHOU Qi-feng, LI Shu-nong

中国病理生理杂志,2003,19(4):443-447,-0001,():

摘要

目的:探讨体外定向诱导胚胎干细胞(ESC)发育为造血干细胞(HSC)的方法。方法:将小、鼠E14胚胎干细胞在含于细胞生长因子(SCF)和血管内皮生长因子(VEGF)的甲基纤维素培养基上首先诱导发育为胚胎体(EB),再将EB置于均含SCF、VEGF、IL-3、IL-6及促红细胞生成素(EPO)的3各不同培养体系中定向分化为HSC,并观察HSC表面标志性抗原、造血集落形成及瑞氏-姬姆萨染色的结果。结果:经两阶段诱导ESC分化为HSC,发现在甲基纤维半固体培养体系中HSC发育缓慢,分化14d后CD34+/Sca-1+细胞数量最高为(31.5+-4.7)%;而在骨髓基质细胞饲养层上HSC发育缓慢较快,细胞数量较多,分化第10dCD34+/Sca-1+细胞数即达到峰值,为(47.8+-6.3)%;骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系中HSC发育同样迅速,所产生的CD34+/Sca-1+细胞数量在3个体系中最高,为(53.6+-7.2)%。经瑞氏-姬姆萨染色证实上述细胞为早期造血细胞,均有形成各系造血细胞集落的能力。结论:使用骨髓基质饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系及SCF、VEGF、IL-3、IL-6及EPO等细胞因子,通过阶段诱导分化,可从小鼠ESC获得较高比例的HSC。

关键词: 胚胎干细胞, 造血干细胞, 骨髓细胞, 分化, 小鼠

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2006年01月11日

【期刊论文】体外定向诱导E14小鼠胚胎干细胞为肝细胞

黄绍良, HUANG Shao-liang, MIN Jun, GUO Zhong-min, WU Yan-feng, BAO Rong

中华肝脏病杂志,2004,12(12):714-717,-0001,():

摘要

目的 探索体外定向诱导胚胎细胞分化为肝细胞。方法 常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后,进行悬滴-悬浮培养,形成胚胎体,再进分阶段定向诱导,在培养第q~12天、第12~18天以及第15~18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细生长因子和制制瘤素M,利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,逆转取聚合酶链反应(RT-PCR)法分析特异性基因nRNA的表达,并用吲垛氰绿(ICG)摄取和过碘酸雪夫反就(PAS)分析细胞的分化用或能。结果 存诱导培养的第13天,细胞出现肝细胞样改变。RT-PCR分析可见,在诱导的第6天和第12天分别可以检测到内胚层或卵黄曩分化标志基因——甲状腺素运载蛋白和α1抗胰蛋白酶的mRNA表达,第6天出现未成熟肝细胞标志基因——甲胎蛋白mRNA表达,第9天第15天和第18天分别开始出现成熟肝细胞的特异性标志基因——白蛋白、葡萄糖6磷酸酶、酪氨酸氨基转移酶mRNA表达。同时,ESC源性肝细胞表现为ICG摄取和RAS反应阳性、经过诱导,ICG阳性 细胞数约占85.1%。结论 ESC源性肝细胞具备肝细咆特性,ESC有可能成为肝细胞治疗的替代供体细胞。

关键词: 胚胎 干细胞, 肝细胞, 分化

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2005年07月19日

【期刊论文】胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

唐仕波, 邱观婷, 黄冰

中华医学杂志2000,12(80):936~938,-0001,():

摘要

目的探讨胚胎干细胞(ES)向神经细胞定向分化发育的可能性。方法ES2D3在无小鼠白血病抑制因子(mLIF)存在的条件下培养ES细胞4d,形成ES集落(即胚胎样小体),经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上,再经全反视黄酸(RA)诱导4d。然后分别作免疫组织化学、RT2PCR检测,鉴定分化细胞的特征。结果上述细胞表达MAP22和GFAP蛋白。RT2PCR分析进一步证明这些细胞能表达γ2氨基丁酸(GABA)γ亚单位和酪氨酸羟化酶以及脑因子21神经相关基因。结论ES细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。

关键词: 胚胎 干细胞, 细胞分化, 神经元

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2005年07月19日

【期刊论文】胚胎干细胞视网膜下移植实验研究初步报告

唐仕波, 邱观婷, 李加青, 卢凤荷

中华眼底病杂志2000,4(16):253~256,-0001,():

摘要

目的探讨胚胎干细胞(mbronic stem cell,ESC)视网膜下间隙分化发育的情况。方法ESC经体外悬浮培养4d形成胚胎体(embryonic body,EB)备作移植。将ESC以及EB联合或不联合视黄酸(retinoic acid,RA)分别移植到SD大鼠玻璃体腔或视网膜下,在视网膜下间隙移植眼,于移植前结扎眼动脉40s造成缺血再灌注损伤的实验模型。于移植后14~28d摘除眼球,观察移植物分化发育的情况。结果ESC在SD大鼠玻璃体腔内迅速增生,形成非典型性增生团块;EB在缺血再灌注损伤眼视网膜下间隙经RA诱导能定向分化为视网膜感光细胞;而在无RA作用下向多极化分化发育。单独RA视网膜下间隙注射后导致神经视网膜上皮增生变厚。结论ESC源性的EB在缺血再灌注眼视网膜下间隙经RA诱导能向视网膜感光细胞分化。

关键词: 干细胞, 细胞移植, 胚胎 视网膜变性 治疗

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2005年07月19日

【期刊论文】人胚眼视网膜光感受器细胞的体外培养和鉴定

唐仕波, 罗燕, 林少芬, 郑湖玲, 郑健, 黄强

中华眼科杂志2001,3(37):178~181,-0001,():

摘要

目的探讨人胚眼视网膜光感受器细胞的获取和体外培养方法,为进行人类视网膜光感受器细胞移植提供理论依据。方法采用酶分层消化法分离获取人胚眼纯视网膜光感受器细胞,使用视网膜色素上皮细胞的条件培养液,在体外长期培养并进行形态学鉴别;用苏木素2伊红染色显示消化后的视网膜组织结构层次,以确定所获取的视网膜光感受器细胞的纯度;用抗视杆细胞特异性视紫质蛋白抗体(rhodopsin4D2,Rho4D2)免疫细胞化学染色做细胞鉴定。结果 酶分层消化法能获取较纯的视网膜光感受器细胞,抗Rho4D2阳性,并能在体外存活较长时间。结论酶分层消化法所获取的人胚眼纯视网膜光感受器细胞能在体外较长时间存活,并可表达光感受器细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞来源。

关键词: 视网膜, 光感受器, 胚胎 体外研究, 细胞培养, 视紫质

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2005年07月22日

【期刊论文】角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究

王智崇, 陈家祺, 葛坚, 黄冰

,-0001,():

摘要

目的:探索角膜基质接触诱导ES细胞定向分化的可能性。方法:分别在去上皮的新西兰白兔表层角膜缘基质上、晶状体上皮细胞饲养层上培养ES-D3细胞,形成复层细胞后,行活体移植,用扫描电镜和光镜观察。结果:1.ES细胞在新鲜表层角膜缘基质上增殖缓慢,2~3周形成较大细胞集落,光镜下细胞形态单一,体积较正常ES细胞大,电镜下细胞核已演变为细长形,移植到裸鼠皮下2周形成细胞复层,电镜下可见微绒毛,而角膜基质非上皮面的ES细胞仍保持其小细胞状态不变。2.晶状体上皮细胞与ES细胞共培养只能延缓其分化时间,不能诱导其定向分化,复层细胞移植后的棉衣组化显示:AE5阳性表达。结论:表层角膜缘基质具有诱导ES细胞定向分化的潜能,体外培养条件下可能不发生晶状体诱导的第三级胚胎诱导。

关键词: 胚胎干细胞 角膜缘干细胞 胚胎诱导 基质 定向分化

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