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2006年11月03日

【期刊论文】体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究*

葛坚, 陶靖, 葛坚△, 黄冰, 王智崇, 郭彦, 余克明, 陈慧怡, 陈系古

中国病理生理杂志,2003,19 (3): 289-292,-0001,():

摘要

目的:探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性。方法:ESCs经胚胎体阶段,以视黄酸及视网膜müller细胞诱导,在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增7d,观察形态变化,采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物,并对其扩增及分化能力进行观察。结果:ESCs经初级诱导,NSCs选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性,整合BrdU,表达nestin、glutaminase、Brn-3基因,且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论:视黄酸及müller细胞诱导的ESCs,经选择性培养基筛选培养可获得NSCs,有望为青光眼等神经变性疾病提供新的治疗途径。

关键词: 胚胎干细胞, 神经再生, 小鼠

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2006年11月02日

【期刊论文】蛋白激酶Cα 在小鼠胚胎干细胞定向分化中对发育基因表达的调控作用

葛坚, 高前应, 王智崇, 陈慧怡, 黄丹平, 袁钊辉

中华眼科杂志,2005,41(2):123~127,-0001,():

摘要

目的探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对小鼠胚胎干细胞(ESCs)定向诱导分化中发育基因(pax26、slit22、netrin21)表达的影响。方法ES2BALB/c细胞株用无白血病抑制因子(mLIF)的ESCs培养液培养4d,形成胚胎体(EBs),再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,经5×10-7mol/L视黄酸(RA)诱导后,用神经细胞特异性抗原NSE和NF2200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后1、3、5、7及14d用逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)方法测定细胞的PKCα和发育基因的mRNA表达情况,并观察了PKC激活剂佛波酯(PMA)和PKC抑制剂D2鞘氨醇对它们表达的影响。结果 免疫组化发现在诱导后第3d大多数细胞NSE和NF2200染色阳性,RT2PCR证实诱导后1dPKCα、pax26和netrin21的mRNA表达急剧下降,3~7d逐渐升高,至14d恢复至正常水平,而slit22在诱导前后均无明显表达。PMA可使PKCα、pax26、netrin21的mRNA水平在诱导后细胞中的表达明显增强,而D2鞘氨醇的作用相反,使它们的表达显著降低,而对slit22无明显影响。结论发育基因pax26和netrin21在ESCs定向分化为神经样细胞中有重要的调控作用,可能是通过PKCα信号通路起作用。

关键词: 胚胎;  干细胞;  蛋白激酶C;  细胞分化;  基因表达调控, 发育期;  小鼠

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2006年11月02日

【期刊论文】SD 大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

葛坚, 杨智宽, 郭彦, 王智崇, 刘海泉

中华眼底病杂志,2002,18(2):134~136,-0001,():

摘要

目的探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)体外分化的诱导作用。方法收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液,抽滤后按2:3比例与DMEM培养液混合,用该混合液进行ES细胞的诱导分化,每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilamentprotein,NFP)免疫组织化学检查。结果加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构,NFP免疫组织化学染色阳性。结论SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。

关键词: 胚胎诱导,  细胞分化,  神经元,  干细胞,  动物实验替代试验

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2005年07月19日

【期刊论文】胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

唐仕波, 邱观婷, 黄冰

中华医学杂志2000,12(80):936~938,-0001,():

摘要

目的探讨胚胎干细胞(ES)向神经细胞定向分化发育的可能性。方法ES2D3在无小鼠白血病抑制因子(mLIF)存在的条件下培养ES细胞4d,形成ES集落(即胚胎样小体),经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上,再经全反视黄酸(RA)诱导4d。然后分别作免疫组织化学、RT2PCR检测,鉴定分化细胞的特征。结果上述细胞表达MAP22和GFAP蛋白。RT2PCR分析进一步证明这些细胞能表达γ2氨基丁酸(GABA)γ亚单位和酪氨酸羟化酶以及脑因子21神经相关基因。结论ES细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。

关键词: 胚胎 干细胞, 细胞分化, 神经元

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2005年07月19日

【期刊论文】胚胎干细胞视网膜下移植实验研究初步报告

唐仕波, 邱观婷, 李加青, 卢凤荷

中华眼底病杂志2000,4(16):253~256,-0001,():

摘要

目的探讨胚胎干细胞(mbronic stem cell,ESC)视网膜下间隙分化发育的情况。方法ESC经体外悬浮培养4d形成胚胎体(embryonic body,EB)备作移植。将ESC以及EB联合或不联合视黄酸(retinoic acid,RA)分别移植到SD大鼠玻璃体腔或视网膜下,在视网膜下间隙移植眼,于移植前结扎眼动脉40s造成缺血再灌注损伤的实验模型。于移植后14~28d摘除眼球,观察移植物分化发育的情况。结果ESC在SD大鼠玻璃体腔内迅速增生,形成非典型性增生团块;EB在缺血再灌注损伤眼视网膜下间隙经RA诱导能定向分化为视网膜感光细胞;而在无RA作用下向多极化分化发育。单独RA视网膜下间隙注射后导致神经视网膜上皮增生变厚。结论ESC源性的EB在缺血再灌注眼视网膜下间隙经RA诱导能向视网膜感光细胞分化。

关键词: 干细胞, 细胞移植, 胚胎 视网膜变性 治疗

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2005年07月19日

【期刊论文】人胚眼视网膜光感受器细胞的体外培养和鉴定

唐仕波, 罗燕, 林少芬, 郑湖玲, 郑健, 黄强

中华眼科杂志2001,3(37):178~181,-0001,():

摘要

目的探讨人胚眼视网膜光感受器细胞的获取和体外培养方法,为进行人类视网膜光感受器细胞移植提供理论依据。方法采用酶分层消化法分离获取人胚眼纯视网膜光感受器细胞,使用视网膜色素上皮细胞的条件培养液,在体外长期培养并进行形态学鉴别;用苏木素2伊红染色显示消化后的视网膜组织结构层次,以确定所获取的视网膜光感受器细胞的纯度;用抗视杆细胞特异性视紫质蛋白抗体(rhodopsin4D2,Rho4D2)免疫细胞化学染色做细胞鉴定。结果 酶分层消化法能获取较纯的视网膜光感受器细胞,抗Rho4D2阳性,并能在体外存活较长时间。结论酶分层消化法所获取的人胚眼纯视网膜光感受器细胞能在体外较长时间存活,并可表达光感受器细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞来源。

关键词: 视网膜, 光感受器, 胚胎 体外研究, 细胞培养, 视紫质

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