【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序，de novo组装球囊菌的参考转录组，并对其进行功能与代谢通路注释，进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子，配制含1×107孢子/mL的饲料饲喂4, 5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫，通过Illumina HiSeqTM 2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序，原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes，进而通过BLASTX比对NCBI Nr, Swiss-Prot, KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索，并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物，通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads，de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示，29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多，达6 050个。KEGG注释结果显示，unigenes可注释到117个代谢通路，其中富集在核糖体（ribosome）上的unigenes数量最多（529）。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs，通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组，并进行了功能与代谢通路注释，可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。

【目的】本研究旨在通过趋势分析对胁迫意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica（简称意蜂）幼虫肠道的球囊菌Ascosphaera apis的差异表达基因（DEGs）进行转录组分析。【方法】将纯化的球囊菌孢子配制为1×107孢子/mL的饲料饲喂意蜂3日龄幼虫，利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道cDNA进行测序，将过滤得到的有效读段（clean reads）映射（mapping）到核糖体数据库及mapping意蜂参考基因组，最后mapping到本课题组组装并注释的球囊菌参考转录组。利用STEM软件对DEGs进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。最后，通过对随机选取6个DEGsd的RT-qPCR分析对RNA-seq数据进行验证。【结果】球囊菌胁迫意蜂幼虫肠道样品的Illumina测序共得到球囊菌的25 454 076条原始读段（raw reads），经过滤得到24 909 820条clean reads，Q30均在93.46%以上。趋势分析结果显示，19 893个DEGs聚类为8个表达模式，其中有12 151个DEGs聚类为3个表现为显著上调趋势的表达模式。GO富集分析结果显示，表现上调趋势的DEGs富集在40个GO term，富集基因数最多的为细胞进程（cellular process）（2 601 unigenes），其次为代谢进程（metabolic process）（2 553 unigenes）和细胞（cell）（2 522 unigenes）。KEGG代谢通路富集分析结果显示，上调趋势中的DEGs富集在119个代谢通路上，其中富集基因数最多的是核糖体（ribosome）（213 unigenes），其次为氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）（154 unigenes）和内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）（130 unigenes）。共有48个DEGs富集在MAPK信号通路上，聚类分析结果显示，这些DEGs随着胁迫时间的延长表达水平逐渐增强。RT-qPCR结果显示，6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致，证明了本研究中的转录组数据真实可靠。【结论】本研究为在分子水平揭示球囊菌的致病机理提供了重要信息，也为阐释球囊菌胁迫意蜂幼虫过程中的病原-宿主互作机制奠定了基础。

【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂（中蜂）幼虫肠道进行深度测序，经趋势分析得到差异表达基因（DEG）的显著表达模式，进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序，将有效读段（clean reads）先映射定位（mapping）核糖体数据库，再mapping中蜂幼虫肠道参考转录组，过滤后的clean reads 进而mapping球囊菌参考转录组。利用STEM软件对胁迫过程中球囊菌的基因表达模式进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路（pathway）富集分析。最后，通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行验证。【结果】本研究中，经过滤得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式，其中，16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果表明，显著上调与显著下调趋势中的DEGs富集于40与37个GO term，基因富集数最多的为细胞进程（cellular process）（2486 unigenes）和细胞（cell）（708 unigenes）。KEGG pathway富集分析显示显著上调与显著下调趋势中的DEGs富集在119和112个pathway上，基因富集数量最多的是氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）（127 unigenes）与核糖体（ribosome）（98 unigenes）。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖，而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。共有11个DEGs富集在MAPK信号通路，它们的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降，推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。RT-qPCR结果显示6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致，证明了本研究中转录组数据的可靠性。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息，也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前，尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康（AcCK）及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道（AcT）进行深度测序，在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina HiSeq 2500平台对AcCK和AcT进行双端（PE125）测序，首先对测序数据进行质控和评估，利用edgeR软件进行差异表达基因（DEG）分析，进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析，最后，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证测序数据的可靠性。【结果】 AcCK和AcT 的转录组测序共得到188 457 338条原始读段（raw reads）, 经过滤得到182 088 448条有效读段（clean reads），两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上，说明测序数据质量良好；主成分分析（PCA）结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体方差的75.8%和10.7%；DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个；GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类（term）上，其中基因富集数最多的细胞（106 unigenes）、细胞组件（106 unigenes）和代谢进程（104 unigenes）；KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上，其中上调基因富集数最多的是核糖体（72 unigenes）、碳代谢（16 unigenes）和糖酵解（14 unigenes），而下调基因富集数最多的是碳代谢（9 unigenes）、二羧酸代谢（8 unigenes）和氨基酸生物合成（7 unigenes），进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答，而体液免疫不产生应答，宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答，为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息，也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂Apis cerana cerana（简称中蜂）幼虫肠道参考转录组进行de novo组装，并进行功能及代谢通路注释，进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫，将纯化的球囊菌孢子饲喂3日龄幼虫，剖取4、5和6日龄幼虫肠道，液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis（简称球囊菌）的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads，利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx（E-value＜10−5）比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库，对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索，并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物，通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads，de novo组装得到43 557个unigenes，平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库，单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示，11 442条unigenes分布于25个基因家族，其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多，达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示，在生物学进程分类中，注释到细胞进程的基因最多，达4 201个，在分子功能和细胞组分类中，注释到结合与细胞的基因数最多，分别为4 935和2900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路，注释到核糖体的基因数最多，达385个。利用MISA软件，可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点，随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增，有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】本研究成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组，可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息，也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组，基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记，可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究，也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。