目的 研究人类疱疹病毒8型（HHV-8）开放读码框架（ORF）50基因启动子在HIV-1感染相关细胞因子肝细胞生长因子/驱散因子（HGF/SF）诱导原发性渗出性淋巴（PEL）BC-3中潜伏感染的HHV-8复制过程中的作用。方法 将HGF/SF连续加入到体外培养的BC-3中，分别于培养第3天和第7天收集刺激细胞，电子显微镜观察成熟HHV-8病毒的形成；提取细胞总RNA，North-ernblot和定量聚合酶链反应（PCR）法检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26mRNA转录。同时，将已构建的HHV-80RF50启动子+虫荧光紊酶报告基因重组质粒和含HIV-1Tat基因重组表达质粒分别共转染BC-3和人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs），转染后24h加入HGF/SF和/或重组HIV-1gp120刺激，刺激后24h收集细胞，进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯（TPA）刺激为阳性对照。结果 HGF/SF可以上调HHV-80RF26mRNA表达，且于刺激的第7天，ORF26mRNA表达上升了4.1倍，BC-3细胞中同时可观察到成熟的HHV-8病毒粒子；HGF/SF能够诱导ORF50启动子活性，但HIV-1Tat和gp120蛋白与HGF/SF协同上调ORF50启动子活性的能力较弱。结论 HIV-1感染相关细胞因子HGF/SF诱导HHV-8复制的过程至少有部分由ORF50启动子介导。

目的 研究HIV-1感染中相关细胞因子IFN-γ对人类疱疹病毒8型（HHV-8）Rta基因启动子活性影响；评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性。方法 将已构建的HHV-8Rta启动子+虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV-1Tat基因重组表达质粒转染多种细胞，转染后24h加入IFN-γ和/或重组HIV-1gp120刺激，刺激后24h收集细胞，进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照，进行最佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较。结果 ①HHV-8Rta启动子启动活性在TPA刺激后的24h达到最高峰；②HHV-8Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV-8和/或EBV基因组的存在，且在血管内皮细胞（HUVECs）中启动活性最佳；③IFN-γ可以诱导Rta启动子活性；但HIV-1Tat和gp120蛋白与IFN-γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱。结论 HIV-1感染中相关细胞因子IFN-γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV-8的复制。

用HindⅢ将HIV-1Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出，BamHI、NotⅠ将绿色荧光蛋白（GFP）编码基因从表达质粒pcDNA31+/GFP中切出，分别插入到质粒LZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101和LZRS-GFP。采用磷酸钙转染法将两重组质粒转染到含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞Phoenix（ΦNX）中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。分别收集稳定细胞系分泌的病毒上清，并感染体外培养的原发性渗出性淋巴瘤（PEL）BCBL-1细胞。收集LZRS-GFP重组病毒感染的BCBL-1细胞进行流式细胞计数，检测GFP表达水平。收集LZRS-Tat101重组病毒感染的BCBL-1细胞，提取蛋白作Westernblot，检测Tat蛋白表达状况；取细胞总RNA作Northernblot和定量PCR，检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26mRNA转录水平。重组LZRS-Tat101病毒进一步感染HL3T1细胞（HeLa细胞包含HIV-1-LTR/CAT报告基因），收集感染细胞提取蛋白，检测CAT活性，评价Tat生物学功能。PCR扩增HHV-8复制和转录激活蛋白Rta启动子区上游序列，并克隆至pGL-3载体中，构建Rta启动子+虫荧光素酶（Luciferase）报告基因重组质粒。此重组质粒进一步电转染预先感染了LZRS-Tat101病毒的BC-3细胞，TPA刺激后收集细胞，检测Luciferase活性。结果显示:①重组反转录病毒感染BCBL-1细胞，一次感染效率达56%；②重组LZRS-Tat101病毒能够在其感染的BCBL-1细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能；③Tat蛋白不能有效上调HHV-8Rta启动子活性；④细胞内HIV-1Tat蛋白诱导HHV-8可溶性周期复制的能力较弱。提示，单纯HIV-1Tat蛋白并不能激活潜伏感染的HHV-8

目的 构建含HIV-1Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出，插入到表达质粒LZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细phoenix（ΦNX）中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化（IHC）染色检查Tat在临时转染和稳定转染ΦNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Westernblot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞（HeLa-HIV-1-LTR/CAT报告基因）中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染ΦNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平；②临时转染病毒感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。

运用细胞融合、细胞混合培养、条件培养基培养和病毒直接刺激等方法，研究人类疱疹病毒6型（HHV6）对卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）溶解性周期复制的影响。①将HHV6感染的JJhan细胞（T淋巴细胞系）与BCBL-1细胞（原发性渗出性淋巴瘤，PEL）进行细胞融合形成异核体细胞。②将HHV6感染的JJhan细胞与BCBL-1细胞进行混合培养。③收集HHV6感染的JJhan细胞培养上清液作为条件培养基进行灭活处理，以灭活前后的条件培养基培养BCBL-1细胞。进一步离心纯化HHV6病毒颗粒，并感染BCBL-1细胞，分别设紫外线和热灭活的HHV6病毒颗粒感染BCBL-1细胞为对照。提取上述的实验细胞总RNA，RT-PCR和/或实时定量（Real-time）PCR检测卡波济瘤相关疱疹病毒（KSHV）次要衣壳蛋白编码基因ORF26mRNA转录。结果显示：①细胞融合后15h开始出现明显细胞病变，RT-PCR检测不同时间的实验组ORF26mRNA转录水平均明显高于对照组；Real-timePCR检测各时间ORF26mRNA转录水平是对照组的2.3倍以上；②细胞混合培养72h时，实验组ORF26mRNA转录水平是对照组的1.8倍；混合培养5天时，实验组KSHV裂解周期蛋白K8.1表达水平是对照组的2.46倍；③灭活前后的HHV6感染细胞培养上清液培养BCBL-1细胞96h时，ORF26mRNA转录水平分别是对照组的2.73倍和2.22倍；④灭活前后的HHV6均可增强BCBL-I细胞中KSHVORF26mRNA转录水平。提示：HHV6感染可激活KSHV的溶解性周期复制。