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张梦1，沈帅祺1，徐海晶1，钱国英1，马文明1，王志江2**

（1. 浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100；
2. 浙江医药高等专科学校制药工程学院，浙江宁波 315100）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ；College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ；College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ；College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ；College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ；College of Pharmaceutical Engineering,Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo 315100,China 浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100;浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100;浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100;浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100;浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100;浙江医药高等专科学校制药工程学院，浙江宁波 315100315100;;;;315100;31510018758307280;;;;18858259974;13567497872057488222075;;;;057488222075;057488222075浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号浙江万里学院生物与环境学院209室;;;;浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号浙江万里学院生物与环境学院;浙江省宁波市高教园区鄞县大道东段888号123571241@qq.com;344831076@qq.com;645754049@qq.com;qiangy@zwu.edu.cn;m-wm02@163.com;wangzj1978@126.com张梦（1992-），女，主要研究方向：水生动物营养生理及分子调控;;;;马文明(1982-)，女，副研究员、硕导，主要研究方向：甲壳动物的性别调控机理研究;1978-，男，高级工程师，主要研究方向：生物工程张梦;沈帅祺;徐海晶;钱国英;马文明;王志江ZHANG Meng;SHEN Shuaiqi;XU Haijing;QIAN Guoying;MA Wenming;WANG Zhijiang马文明浙江省2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*学位论文*|*代莉.卤虫休眠卵壳蛋白及其参与卤虫胚胎的抗逆性机制研究[D].杭州：浙江大学,2012.<CR>2*|*期刊*|*Clegg JS,Conte F.A review of the cellular and developmental biology of Artemia[J].Wetteren,Belgium:Universa Press,1980,02.<CR>3*|*期刊*|*Linden AVd,Blust R,Cuypers K,et al.An action spectrum for light-induced hatching of Artemia cysts[J].Wetteren,Belgium:Universa Press,1987.<CR>4*|*期刊*|*张强,杨承忠,喻梅辉 等.巴里坤湖卤虫卵卵径和卵色变异及其与孵化率的相关研究[J].八一农学院学报,1994,17(02):34-3.<CR>5*|*期刊*|*吕志华,于广利,王远红 等.卤虫卵壳营养成分分析[J]. 水产科学,2004, 23(l):42-44.<CR>6*|*期刊*|*Drinkwater LE,Clegg JS.ExPerimental biology of cyst diapause[J]. Boca Raton:CRC Press.pp,1991,01:93-117.<CR>7*|*学位论文*|*刘玉磊.卤虫休眠卵壳形成的分子机制及其抗逆功能的研究[D].杭州:浙江大学,2009.<CR>8*|*期刊*|*Yosefali A,Abbasali M,Amin E.Biotechnological approach to produce chitin and chitosan from the shells of Artemia urmiana gunther,1899(Branchiopoda,Anostraca)cysts from Urmia Lake,Iran[J].Leiden,Holand:Koninklijke Brill NV,1999.<CR>9*|*期刊*|*Adamkova.I.Hatching quality of Artemia(Artemia salina)cysts treated with commercial hypochlorite product Savo[J].Jihoceska Univ,Vodnany,Czech Republic,1999.<CR>10*|*期刊*|*王旭,何冰芳,李霜 等.Tricine-SDS-PAGE电泳分析小分子多肽[J].南京工业大学学报:自然科学版,2003,25(2):79-81.<CR>11*|*期刊*|*曹佐武.有效分离1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法[J].中国生物工程杂志,2004,24(1):74-76.<CR>12*|*期刊*|*Hermann Schagger.Tricine-SDS-PAGE[J].Nature Protocols,2006,1(1):16-22.<CR>13*|*期刊*|*石继红,赵永同,张英起 等.应用SDS-PAGE显示小分子多肽技术的探讨[J].生物工程进展,2001,21(01):38-41.<CR>14*|*期刊*|*曹佐武.尿素改善SDS-PAGE分离小分子肽的效果[J].生物技术,2003,13(05):23-24.卤虫泌壳腺特异表达蛋白SGEG1的原核表达|Prokaryotic Expression of SGEG1 Protein from Artemia Diapause Cysts|浙江省|1|张梦|ZHANG Meng|浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100|College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China |张梦（1992-），女，主要研究方向：水生动物营养生理及分子调控|浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号浙江万里学院生物与环境学院209室|315100|123571241@qq.com|057488222075|18758307280<CR>|2|沈帅祺|SHEN Shuaiqi|浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100|College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ||||344831076@qq.com||<CR>|3|徐海晶|XU Haijing|浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100|College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ||||645754049@qq.com||<CR>|4|钱国英|QIAN Guoying|浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100|College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China ||||qiangy@zwu.edu.cn||<CR>*|5|马文明|MA Wenming|浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100|College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China |马文明(1982-)，女，副研究员、硕导，主要研究方向：甲壳动物的性别调控机理研究|浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号浙江万里学院生物与环境学院|315100|m-wm02@163.com|057488222075|18858259974<CR>|6|王志江|WANG Zhijiang|浙江医药高等专科学校制药工程学院，浙江宁波 315100|College of Pharmaceutical Engineering,Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo 315100,China |1978-，男，高级工程师，主要研究方向：生物工程|浙江省宁波市高教园区鄞县大道东段888号|315100|wangzj1978@126.com|057488222075|13567497872

摘要：卤虫（丰年虾）是一种能在极端环境下生存的小型海洋动物，其休眠卵可以在干燥、缺氧的环境中保持长久活力，并且在合适条件下发育成幼虫，卤虫依靠其休眠状态渡过极端环境。卤虫泌壳腺特异表达蛋白（Shell Gland-specifically Expresses Gene, SGEG）是休眠卵壳蛋白的重要组成部分，是卵生卤虫卵囊泌壳腺分泌型细胞上特异性表达的基因，参与卤虫在极端环境中的抗逆休眠机制。本文将卤虫SGEG1基因成熟肽序列克隆到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)中，构建含pET-28a(+)-SGEG1重组质粒，转化至大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)中，诱导表达重组蛋白。通过对诱导的IPTG浓度、诱导时间和蛋白电泳检测方式的优化，确定最佳表达条件和蛋白电泳检测方法。本研究成功构建pET-28a(+)-SGEG1重组载体，实现分子量约为10 KDa小分子重组SGEG1蛋白的高效表达，其融合蛋白主要以包涵体形式存在，为开展SGEG1蛋白的体外制备奠定了基础。

关键词：卤虫；SGEG1；原核表达

中图分类号：Q78

ZHANG Meng1, SHEN Shuaiqi1, XU Haijing1, QIAN Guoying1, MA Wenming1, WANG Zhijiang2

(1. College of Biology and Environment,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China;
2. College of Pharmaceutical Engineering,Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo 315100,China)

Abstract: Artemia is a small marine animal survived in extreme environments. Its diapause cysts can maintain long-term vitality in dry and anoxic environment and develop into larvae under suitable condition. Artemia passed through the extreme environment by its dormancy state. The shell gland-specifically expresses gene (SGEG) is specifically expressed in secretory cells of shell gland of oviparous Artemia’s ovisac and SGEG peptide is an important component of diapause cysts shell protein. In this study, the SGEG1 gene sequence of deduced mature peptide was cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a (+) with 6×His tag. A recombinant plasmid containing pET-28a (+)-SGEG1 was successfully constructed and transformed into E. coli BL21(DE3). The fusion expression of recombinant SGEG1 (rSGEG1) protein was induced. Meanwhile, the induced IPTG concentration, induction time of rSGEG1 and the method of protein electrophoresis were optimized. The recombinant SGEG1 peptide with a molecular weight of about 10 KDa was highly expressed,and the fusion protein mainly existed in the form of inclusion body, which supported a foundation for the preparation of SGEG1 protein in vitro.

Key words: Artemia;SGEG1; prokaryotic expression

引言

卤虫也称盐水丰年虫或丰年虾，属于节肢动物门，是一种休眠状态下能度过极端恶劣环境的小型海洋动物。卤虫的繁殖有两种生殖方式，即卵胎生和卵生。卵胎生是指子代自母体内产出时已孵化为无节幼体，而卵生则指子代以卵的方式自母体内产出。当外界环境条件较差时，卵生途径的卤虫产生休眠卵，其可在长期缺氧、脱水、极端温度和γ-射线等条件下，依然保持很高的活力和孵化率[1-4]。卤虫休眠卵孵化后的无节幼体，是鱼、虾蟹等水产养殖过程中广为使用的活体饵料[5]，具有重要的经济价值。

卤虫休眠卵外层为复杂的非细胞卵壳，与其细胞内部p26、Artemin等因子一起形成特有的抗逆机制。泌壳腺特异性表达基因（Shell Gland-specifically Expressed Gene，SGEG）是仅存在于卵生途径卤虫的卵囊泌壳腺分泌型细胞上特异性表达的基因，是卤虫休眠卵壳蛋白的重要组成部分，参与休眠卵对极端环境的抗逆机制[6]。SGEG1基因是卤虫SGEG基因家族的成员之一，其cDNA全长450bp，具有345bp开放阅读框，推演的多肽由33个氨基酸信号肽和81个氨基酸成熟肽组成，其对卤虫卵壳高度有序的组装及参与保护休眠胚胎免受各种极端环境的胁迫有重要意义[7,8]。

本研究将卤虫SGEG1基因成熟肽序列克隆到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)中，进行蛋白诱导和体外表达，优化SGEG1重组蛋白最佳诱导条件[9,10]和电泳检测方式[11,12]，实现目的蛋白的高效表达和体外制备。

材料和方法

材料和仪器

Taq DNA聚合酶、DNA 分子量标准、蛋白分子量标准、卡那霉素、蛋白胨、酵母粉、40%丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺溶液（29:1）、尿素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白电泳缓冲液、DNA片段回收试剂盒、凝胶切胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。T4 DNA连接酶、Nco I和Xho I购自Takara公司。pET-28a(+)质粒、E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）菌种为本实验室保存。凝胶成像系统（杭州宝诚生物技术有限公司）

实验方法

pET-28a(+)-SGEG1原核表达载体的构建

根据GenBank中SGEG1基因cDNA序列（基因序列号EU683079.1）及原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点序列，设计带有酶切位点的PCR扩增引物：上游引物SGEG1 F：5’- CATGCCATGGGGAAGAAGAAGGAAAAGATTACGGA-3’（下划线处为Nco I酶切位点）；下游引物SGEG1 R：5’-CCGCTCGAGCAGGTCTCTCCCCTGGTCTT-3’（下划线处为Xho I酶切位点），扩增SGEG1成熟肽序列。同时，在下游引物紧邻终止密码子的3’端引入编码6个组氨酸核酸序列，表达由91氨基酸组成的重组蛋白。

尕海孤雌卤虫（Artemia parthenogenetica），用于RNA的提取和cDNA的合成。利用PCR方法，扩增SGEG1成熟肽序列。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分析，并用DNA回收试剂盒纯化备用。

SGEG1纯化产物和pET-28a(+)载体分别用Nco I和Xho I双酶切，酶切产物纯化后经T4 DNA Ligase 16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α，挑选阳性克隆进行测序，确定目的片段序列及读码框的正确性。

重组SGEG1蛋白的诱导表达

将含有pET-28a(+)-SGEG重组质粒的E.coli BL21（DE3），接种于含卡那霉素（终浓度为30 μg/ml）的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，随后按1：50比例扩大培养至OD600=0.4-0.6之间，加入IPTG诱导表达目的蛋白。诱导表达后的菌液，4℃，5000 rpm离心10 min，收集菌体沉淀。在溶菌酶作用下，37℃作用30min；随后转至液氮中30s，37℃水浴2min反复冻融6次，加入Triton-X-100（终浓度2%）室温间隔震荡30min，彻底破碎菌体。离心分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE蛋白电泳检测目的蛋白的表达和存在形式。

确定蛋白诱导的最佳IPTG浓度

将表达菌的菌液培养至OD600=0.4-0.6时，等量分装至4瓶，分别加IPTG至终浓度0mM、0.4mM、0.8mM、1mM，37℃诱导培养4h，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀， SDS-PAGE电泳分析，确定最佳诱导浓度。

确定蛋白表达的最佳诱导时间

将表达菌的菌液培养至OD600=0.4-0.6时，等量分装至3瓶，加入终浓度为1mM IPTG 37℃诱导培养，分别在诱导的0h、 2h 和4h取菌液进行SDS-PAGE检测，确定最佳诱导时间。

确定蛋白的最优电泳条件

重组表达的SGEG1蛋白为小分子多肽，分别利用4种不同的蛋白电泳方式，优化目的蛋白的分离效果。将样品分别置于15%SDS-PAGE（5%浓缩胶，15%分离胶）、15%SDS-PAGE（含6M尿素）、16%Tricine SDS-PAGE（6%浓缩胶，16%分离胶）和16%Tricine SDS-PAGE（含6M尿素）蛋白电泳体系中进行蛋白分离。其中，15%SDS-PAGE蛋白电泳采用恒流15mA，2h电泳。Tricine SDS-PAGE电泳缓冲液则采用阳极和阴极电泳缓冲体系，先恒压30V，30min电泳，待样品进入分离胶后电压升为恒压200V，电泳2h。电泳结束后，考马斯亮蓝R-250染色，脱色，凝胶成像系统拍照观察。

材料和方法

pET-28a(+)-SGEG1原核表达载体的构建

卤虫SGEG1多肽由信号肽和成熟肽两部分组成，本研究中将卤虫SGEG1基因的成熟肽基因序列克隆到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)中进行蛋白表达（Fig. 1A）。

首先，以卤虫cDNA为模板，利用PCR扩增SGEG1成熟肽片段，在约270bp处得到一条单一的特异性条带（Fig. 1B-1）。随后，利用pET-28a(+)质粒，将SGEG1成熟肽序列定向插入，构建重组表达载体pET-28a(+)-SGEG1，并转化至E.coli中。利用PCR方法，进行转化子的鉴定，结果表明，成功扩增到转化子中目的基因。此转化子质粒DNA测序后，证实其与预期基因序列相符，表明成功构建重组表达载体（Fig. 1B-2）。

体外重组表达的SGEG1多肽含成熟肽和组氨酸标签两部分，组成一个由91氨基酸组成的小分子多肽，推演的蛋白分子量为10.537 KDa，等电点为5.69（Fig. 1C）。

图1 SGEG1 重组蛋白的原核表达载体构建

（A）.SGEG1重组蛋白的原核表达策略；（B） SGEG 1基因的PCR产物检测：M：DNA分子量标准；1：SGEG 1基因PCR产物；2：pET-28a(+)-SGEG1转化子的PCR产物；（C）SGEG1重组蛋白氨基酸序列

Fig. 1 Construction of prokaryotic expression vector of recombinant SGEG1 protein

（A）The prokaryotic expression strategy of SGEG1 recombinant protein. （B）PCR product detection of SGEG1: M: DNA molecular weight standard; 1: PCR product of SGEG1; 2: PCR product of pET-28a(+)-SGEG1 transformation.（C）Amino acid sequence of SGEG1 recombinant protein.

重组SGEG1蛋白的诱导表达和检测

重组pET-28a(+)-SGEG1质粒转化至BL21(DE3)中，利用IPTG对其进行诱导，收集产物进行SDS-PAGE电泳检测。结果显示，与未经IPTG诱导的菌体相比，经IPTG诱导后的菌体在约10KDa处出现一条明显条带，与预期SGEG1重组蛋白大小一致，表明构建的pET-28a(+)-SGEG1重组质粒已成功在大肠杆菌中表达。同时，对重组蛋白的可溶性分析结果显示，在大肠杆菌破菌后的菌体沉淀中同样存在一条约10KDa大小的蛋白条带，说明SGEG1重组蛋白主要以包涵体形式存在（Fig. 2）。

图2 SGEG1重组蛋白的诱导表达和可溶性分析

Fig.2 Induced expression and soluble analysis of recombinant SGEG1 protein

SGEG1重组蛋白的表达条件优化

最佳诱导浓度的确定

分别以浓度为0 mM、 0.4 mM、0.8 mM和1mM 的IPTG进行诱导表达并检测分析。蛋白电泳结果表明，IPTG浓度为0.4 mM时，SGEG1的表达量较低，随着IPTG浓度的逐渐升高，SGEG1蛋白的表达量呈现上升趋势（Fig. 3）。因此，选择终浓度为1mM的 IPTG进行诱导表达。

图3 不同IPTG诱导浓度对重组蛋白表达量的影响

Fig.3 Effect of different concentration of IPTG on the expression of recombinant protein

最佳诱导时间的确定

将含有pET-28a(+)-SGEG1的BL21(DE3)表达菌培养至对数生长期，以终浓度为1mM的IPTG分别诱导0h、2h和4h后电泳检测。结果表明，随着IPTG诱导时间的增加，SGEG1重组蛋白的表达量逐渐增加（Fig. 4）。因此，SGEG1重组蛋白最优表达条件为1mM IPTG诱导4h。综上所述，SGEG1重组蛋白最优表达条件： 菌液浓度OD600=0.4-0.6时进行诱导，IPTG终浓度为1mM，37℃诱导4h。

图4 不同诱导时间对重组蛋白表达量的影响

Fig.4 Effect of different induction time on the expression of recombinant protein

重组SGEG1蛋白的电泳条件优化

重组表达的SGEG1蛋白分子量约为10.5kDa，属于小分子肽，常用的蛋白电泳较难实现预期的分离效果。本研究中，分别采用15%SDS-PAGE、15%SDS-PAGE（含尿素）、16%Tricine-SDS-PAGE和16%Tricine-SDS-PAGE（含尿素）蛋白电泳对菌体蛋白进行分离，通过对比四种蛋白电泳结果，挑选最适合分离SGEG1蛋白的电泳和检测方法。

图5电泳结果表明，15%SDS-PAGE电泳方法可以很好地分离20kDa以上蛋白条带，条带边界清晰，效果理想； 20kDa以下条带则呈模糊团状聚集，小分子条带的分离效果不理想。 其次，15%SDS-PAGE（含尿素）电泳条带呈现跑偏情况，且蛋白区条带弥散，未能很好地分离蛋白。再次，利用Tricine代替甘氨酸，借助两性离子缓冲液，进行16%Tricine-SDS-PAGE电泳。电泳结果表明，该法能有效分离样品中不同分子量大小的蛋白，且条带清晰，效果较前两者有明显改善。但电泳过程中产热高，电泳速度较缓。最后，16%Tricine-SDS-PAGE（含尿素）电泳结果表明，不同大小片段的蛋白都能很好地分离且在小分子蛋白条带区域出现边界清晰的条带，证明此法对小分子肽分离效果最佳。与此同时，相同电泳时间条件下，该方法分离速度较16%Tricine-SDS-PAGE更为快速，是重组SGEG1蛋白最优的电泳和检测方法。

图5 四种蛋白电泳分离效果比较

Fig.5 Comparison of separation effects of different protein electrophoresis

讨论

卤虫泌壳腺特异表达蛋白SGEG是休眠卵壳蛋白的重要组成部分，在卤虫卵壳形成过程中发挥重要的功能，参与卤虫在极端环境中的抗逆休眠机制。SGEG基因由刘玉磊[7]等人发现，推测与卤虫休眠卵壳形成相关。代莉[1]等人利用RNAi技术，研究发现，由沉默SGEG1基因的母体卤虫产出的休眠卵前皮质层消失、皮质层厚度仅为正常休眠卵的一半，推测SGEG1分散性表达于前皮质层和皮质层，参与卤虫休眠卵卵壳的构建。

本研究以卤虫cDNA为模版，选用pET原核表达载体，借助Nco I和Xho I限制性内切酶，成功构建了高效表达卤虫SGEG1多肽的pET-28a(+)-SGEG1原核表达载体。同时，通过E.coli BL21（DE3）菌株的诱导表达，获得SGEG1重组蛋白，并证明其主要以包涵体形式存在，为高效获取SGEG1重组蛋白提供了基础资料，为后期纯化及相关功能研究奠定了基础。

同时，为高效表达SGEG1重组蛋白，对原核表达诱导条件进行了优化。IPTG诱导剂价格较为昂贵，且对细菌存在一定毒性。延长诱导时间可以使蛋白表达量升高，但也可能使蛋白降解和菌体老化，反作用于蛋白表达量。本实验通过对SGEG1重组蛋白诱导的IPTG浓度和诱导时间进行摸索，确定了SGEG1重组蛋白最优表达条件为菌液浓度为OD600=0.4-0.6时进行诱导，IPTG终浓度为1mM，37℃诱导4h。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）常用于分离蛋白质，普通的Tris-甘氨酸-SDS-PAGE多用来分离分子量在10-200kDa的蛋白质，当分子量小于10kDa的小分子肽时，分离效果欠佳。本研究中推演的SGEG1重组蛋白分子量为10.537kDa，常用的SDS-PAGE并不是很适用。而Tricine-SDS-PAGE常用于分离分子量1-10kDa的小分子肽类，Tricine以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带[13]。同时，在蛋白电泳中加入尿素能够明显改善小分子肽分离效果，提高分辨率[13,14]。同时，通过对常规的SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE电泳进行改进，在电泳的分离胶中加入尿素，可改变胶的孔径，有效压缩小分子多肽，减弱拖尾现象。本研究中，通过四种蛋白电泳方法的比对，为小分子肽的高效分离提供了良好的技术支持。

卤虫的SGEG1重组表达蛋白制备的成功为进一步研究卤虫休眠卵卵壳蛋白功能以及卤虫的滞育、抗逆机理打下了基础，为开发隔离紫外线、耐腐蚀、耐高温的新型生物材料提供了新的思路。

[参考文献] (References)

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[14] 曹佐武.尿素改善SDS-PAGE分离小分子肽的效果[J].生物技术,2003,13(05):23-24.

基金项目：浙江省“生物工程”一流学科开放基金（CX2018003）；浙江省大学科技创新（新苗人才计划）项目；浙江省农业（水产）新品种选育重大科技专项（2016C02055-2和2016C02055-5）；国家自然科学基金（31872545）；“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2018YFD0900200）

作者简介：张梦（1992-），女，主要研究方向：水生动物营养生理及分子调控

通信联系人：马文明(1982-)，女，副研究员、硕导，主要研究方向：甲壳动物的性别调控机理研究. E-mail: m-wm02@163.com