NAFLD/NASH新药研发关键因素分析

郑晓敏1，何寅武2，张雷1**

（1. 华南理工大学生物科学与工程学院；
2. 广州博济医药科技股份有限公司）

2.02.02.02.02.02.0School of Biology and Biological Engineering,South China University of Technology；Guangzhou Boji Medical Technology Co.,Ltd.；School of Biology and Biological Engineering,South China University of Technology华南理工大学生物科学与工程学院;广州博济医药科技股份有限公司;华南理工大学生物科学与工程学院510006;;51000615989067638;;1866609885915989067638;;18666098859广州市番禺区大学城华南理工大学生物科学与工程学院;;广州市番禺区大学城华南理工大学生物科学与工程学院632902839@qq.com;heyinwu@gzboji.com;lzhangce@scut.edu.cn郑晓敏，女，硕士，药理学;何寅武，男，博士，药理学;张雷，男，博导，化学药物开发、医药生物学郑晓敏;何寅武;张雷ZHENG Xiaomin;HE Yinwu;ZHANG Lei张雷 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*Ludwig J., Viggiano T. R., McGill D. B., et al. Nonalcoholic steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease[J]. Mayo Clin Proc, 1980. 55(7):434-438.<CR>2*|*期刊*|*Younossi Z. M. The epidemiology of nonalcoholic steatohepatitis[J]. Clinical Liver Disease, 2018. 11(4):92-94.<CR>3*|*期刊*|*Zhou F., Zhou J., Wang W., et al. 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摘要：非酒精性脂肪性肝病/肝炎（NAFLD/NASH）是最常见的慢性肝病之一，全球发病率在24%左右，已经成为全球性健康问题。NAFLD/NASH的发病机制复杂，涉及包括脂质沉积、炎症、氧化应激改变、纤维化、胆汁酸异常代谢、肠道菌群失调和易感基因变异等因素之间复杂的相互作用。目前在研的有多种针对不同靶点的新药处于不同临床研究阶段，多项关键的II期和III期研究未达主要终点，这也给这一领域的新药研发提出新的挑战。本文对影响NAFLD/NASH新药研发成功与否的关键因素，包括新的疾病定义及疾病异质性、临床前研究动物模型的选择、临床试验方案的考量等新的方面进行综述，探讨如何提高NAFLD/NASH新药开发的成功率。

关键词：药学；非酒精性脂肪性肝病；代谢相关性脂肪性肝病；动物模型；临床设计

中图分类号：R969.4

Key Factors Affecting on the Drug Development for NAFLD/NASH

ZHENG Xiaomin1, HE Yinwu2, ZHANG Lei1

(1. School of Biology and Biological Engineering,South China University of Technology;
2. Guangzhou Boji Medical Technology Co.,Ltd.)

Abstract: Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) / nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is one of the most common chronic liver diseases. The incidence rate is around 24% worldwide, and has become a global health problem. The pathogenesis of NAFLD/NASH is complex, which involving complex interactions among multi-factors including lipid deposition, inflammation, oxidative stress, fibrosis, abnormal bile acid metabolism, intestinal flora imbalance and susceptibility gene variation, etc. At present, a variety of new drugs with different targets are in various clinical stages, and a number of crucial phase II anKey Factors Affecting on the Drug Development for NAFLD/NASHd phase III researches have not reached the primary end points, which also poses new challenges to the R&D of innovative drugs in this field. This article reviews the key factors affecting the success of innovative drug development for NAFLD/NASH, including the renewed disease definition, the selection of preclinical animal models, the consideration of clinical trial plans, and discusses how to improve the success rate of innovative drug R&D in NAFLD/NASH.

Key words: Pharmacology；NAFLD；MAFLD；animal model；clinical design

引言

1980年，美国医生Jergen Ludwig观察到一类具有明显肝脏病理特征的病人，特征包括肝细胞脂肪变性（steatosis）、气球样变（ballooning）、小叶炎症（lobular inflammation）以及细胞外周纤维化（pericellular fibrosis）。这些病人都没有过度饮酒史，因此他将这种新疾病命名为非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）[1]。据报道，2016年全球NAFLD发病率在24%左右。其中约10%~30%的NAFLD患者会进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。而NASH患者中会有约10%~15%的病人进展为肝硬化以及肝细胞癌[2]。在中国，据2019年的一项研究表明，中国NAFLD的平均发病率为29.2%，高于全球平均水平[3]。目前，已有多种针对不同靶点的NAFLD/NASH新药处于不同阶段的临床研究当中，涉及代谢紊乱、氧化应激、炎症、细胞凋亡、肠道微生物群紊乱以及纤维化等不同发病机制[4]。同时，近年来也有许多之前被普遍看好的NAFLD/NASH新药在关键性临床II期或III期研究中折戟。例如，Gilead公司的ASK1抑制剂selonsertib在两个大型III期研究中针对桥接纤维化（F3）患者和代偿性肝硬化（F4）患者中单用均未表现出任何的纤维化改善效果[5]。Novartis与Conatus公司合作的pan-caspase抑制剂emricasan在针对不同阶段NASH纤维化或肝硬化或门脉高压病人的不同研究中也均未表现出明显的药效[6-8]。2020年5月，Genfit公司公布其PPARα/δ双靶点激动剂elafibranor的III期中期分析结果，与安慰剂相比未能显著改善脂肪肝（纤维化无恶化），错过一级终点，在关键二级终点纤维化改善比例上也与安慰剂组没有差别[9]。此外，一直备受瞩目的Intercept公司的奥贝胆酸治疗NASH适应症的NDA申请也一再被FDA所拒绝[10]，这些无疑都给NAFLD/NASH新药研发蒙上了层层阴影。NAFLD/NASH疾病的复杂性可能远远超出人们的想象。本文从新的疾病定义及疾病异质性、临床前研究动物模型的选择、临床研究方案的考量以及类器官在NAFLD/NASH新药研发中的应用等多个角度出发，综述和讨论影响NAFLD/NASH新药研发成功的多个关键性因素，期望提高未来NAFLD/NASH新药研发成功率。

新的疾病定义及疾病异质性

2020年2月，由悉尼大学Eslam教授、George教授以及弗吉尼亚联邦大学Sanyal教授代表国际脂肪肝专家小组在Gastroenterology公开发表了一篇关于更改NAFLD命名的建议[11]。专家小组达成了以MAFLD（Metabolic associated fatty liver disease）取代NAFLD命名的共识。他们认为，尽管NAFLD/NASH疾病的发展趋势惊人，但随着对疾病认识的不断深入，对于疾病的命名和诊断标准并没有被更新。不同NAFLD患者疾病的主要驱动因素存在异质性，这也可能是目前造成多个药物开发失败的主要障碍。目前大部分临床受试者招募都是基于组织学分级和分期，而事实上不同致病原因也会导致相同的组织学表型。因此，缺乏对于主要致病因素的分析和考虑，是现阶段临床研究的一个关键问题，而显然，处理这种异质性的肝病时采用“一刀切”或者统一的标准是不合适的[12]。

MAFLD致病因素多样且疾病表型复杂，疾病严重程度和自然病史差异很大，患者之间存在巨大异质性[13-14]。虽然肝脏脂肪变性非常普遍，但只有小部分人在任何阶段都出现炎性损伤，更重要的是，即使在很短的时间内，个体也可以在脂肪变性和脂肪性肝炎之间相互转变[15]。虽然脂肪性肝炎患者更容易出现与肝脏相关的并发症（即肝硬化和肝癌），但这种进展并非不可避免[16-17]。此外，在脂肪性肝炎患者中，也存在有进展相当快速和相当缓慢这两种极端的病例[18]。而疾病的发展也会被外在因素干扰，如生活方式[19]、其他疾病的叠加（如2型糖尿病）[20]以及遗传易感性[21]，甚至在部分安慰剂组的受试者以及二级/三级护理条件下两次活检的观察性研究中发现“自发性”退化现象[22-23]。目前尚不清楚在不同的年龄阶段中代谢相关脂肪性肝病进展的倾向性是否有所不同。

脂肪性肝病的临床表现和患者之间的异质性可能受多种因素的影响，这其中包括年龄、性别、激素状况、种族、饮食、饮酒、吸烟、遗传易感性、微生物群和代谢状态[11]。这些不同因素之间的相互作用影响并改变最终的表现和临床病程（见图1）。因此，脂肪肝疾病的异质性决定了它不可能是以“一刀切”的治疗方法来考虑或管理。如果缺乏对异质性影响的考虑，将会削弱精确定义脂肪肝不同表型自然病史的能力，削弱我们选择适当临床试验以获益的能力，以及削弱我们从这些临床研究中比较及分析结果的能力。为实现有效的临床治疗效果，将需要系统地剖析所涉及的致病途径，并可能需要多方面和个性化的治疗方案[24-25]。

图1 代谢相关脂肪肝病的异质性。图片来源于Gastroenterology. 2020, 158(7):1999.[11]

Fig. 1 Heterogeneity in metabolism-related fatty liver disease

临床前研究疾病动物模型的选择

NASH新药研发的一个主要障碍是缺乏理想的临床前疾病动物模型。NASH是由环境因素和遗传因素之间的可变相互作用引起的，这些因素不能在动物身上完全复制。尽管如此，仍然需要临床前动物模型来理解NASH病理生理学和测试基于机制的治疗。理想的NASH临床前研究模型应该是尽可能模仿人类疾病的表型，主要为大泡性脂肪变性、小叶炎症（成人，儿童中可能门脉炎症更突出）、肝细胞气球样变（最好伴有Mallory-Denk小体）和纤维化。病变集中在小叶中心或小叶周围，窦周纤维化开始于III区，然后发展到桥接纤维化和形成肝结节。而一旦出现晚期纤维化，发生肝癌的几率大大增加。此外，动物最好可显示出代谢异常的症状，如肥胖、胰岛素抵抗、高血糖和血脂异常等。目前已经发展出多个NASH模型，这些模型从模仿病因和自然史（致肥胖饮食模型）或组织病理学（营养缺乏模型或化学诱导模型）的点来建立，同时遗传模型（单基因或多基因）在NASH研究中也得到广泛应用，也有模型是以上因素的不同结合[1,2,7,8,26]。

然而，没有任何一个动物模型可以重现NASH。虽然许多动物模型的组织学外观可能类似于人类NASH，但肝脏中的代谢和转录特征可能不是很明显，因此越来越多地根据蛋白质组、脂质组和转录组来评估模型，而不是仅仅基于组织学来评估它们与人类疾病的相关性[3]。NASH小鼠模型目前是测试新型治疗药物的关键平台。模型的选择一定程度上取决于所要解决的问题，可选择的类型如前所述。无论哪种类型，都需要“背景数据”，如体重、组织重量（脂肪组织、肝组织）、肝脂质含量（TG/TC）、胰岛素抵抗、循环代谢产物（空腹血糖、血脂（TG/TC/HDL-C/LDL-C））、损伤（ALT、AST、ALP）、炎症、气球样变和纤维化的组织学分级和分期以及定量形态计量学）[1,7,26]。

致肥胖模型：C57BL/6小鼠对肥胖饮食高度敏感，更容易发生饮食诱导的肝脏坏死性炎症和纤维化，是最常见的NASH模型小鼠品系[5]。饮食配方不同，会导致不同程度的肥胖，通常定义40%-70%脂肪为高脂饮食，0.1%-2%胆固醇为动脉粥样硬化饮食，而约0.2%的胆固醇含量是最常用的，含量过高（＞0.5%）是有毒的，远超人类的摄入量[5,6]。

纯高脂肪或高碳水化合物饮食主要局限是，即便喂养周期很长（≥20-30周），最终只会出现血脂异常、脂肪肝和轻度NASH，而没有明显的纤维化[5]。因此，该类饮食更适用于研究脂肪肝或血脂异常，考虑到药物筛选的高效性，喂养时间通常缩短到10-20周。更成功的饮食策略是在高脂肪、高碳水化合物的饮食中加入多余的胆固醇和果糖，或添加反式脂肪酸，这些饮食被称为致动脉粥样硬化或“西方饮食”也叫“快餐饮食”或高脂肪高胆固醇（HFHC）饮食[26][1]。而目前“西方饮食”被使用最广泛，但可能要喂养更长周期（≥30-40周）才能出现明显纤维化。并且，在“西方饮食”中添加一定比例的反式脂肪酸很有必要，然而目前反式脂肪酸已经被明令禁止。因此，致肥胖饮食对于临床前NASH研究来说可能是次优的，适合表征药物对体重、血脂异常、脂肪肝和一定程度上的炎症的影响[5]。值得一提的是，额外在高脂肪高胆固醇饮食中添加胆盐是一个不错的选择，可以在短周期内（8-12周）出现轻中度脂肪肝，虽然达不到纤维化，但炎症灶非常明显，同样适合评估对肝脏损伤有作用的化合物[4,5]。

营养缺乏模型：为解决大多数高热量饮食对肝纤维化反应不足的问题，许多特殊饮食被开发出来。如CD（胆碱缺乏）、MD（蛋氨酸缺乏）、MCD（蛋氨酸和胆碱缺乏）和半合成CDAA（胆碱缺乏，低含量蛋氨酸，定义L-氨基酸），这些都是临床前NASH研究常用的。相当于给动物提供一个额外的“二次打击”，加重NASH病程，缩短发病时间。这些饮食中的脂肪含量可能不同，而蔗糖含量通常较高，对NASH有不同程度的促进作用。

通常会在CDAA饮食中添加较高脂肪（60%）来增强CDAA饮食的NASH特性。CDAHF（胆碱缺乏，低含量蛋氨酸，定义L-氨基酸，高含量脂肪）饮食喂养8周左右出现脂变、炎症和气球样变，动物体重下降幅度在可接受范围内。MCD饮食喂养1-3周出现大泡脂肪变和炎细胞浸润，5-7周出现较重的窦周纤维化，但是由于体重减轻严重，经常与高脂肪或高蔗糖饮食或遗传肥胖倾向的品系（如db/db小鼠，由于瘦素信号的改变而产生胰岛素抵抗的小鼠品系）结合使用，被用于研究药物治疗的短期效果[1,5,26]。值得注意的是，MCD小鼠的肝纤维化程度在不同的研究实验室似乎不同，可能是由于使用的小鼠品系，饮食组成和饲养条件不同所导致。由于这些模型缺乏致肥胖作用或缺乏胰岛素抵抗表型，如果测试的化合物作用方式涉及改善胰岛素功能，亦或者能减轻体重，则需要多方面结合后慎重选择。因此，营养缺乏模型由于发病机制特殊，可能更多用于评估以肝脏为靶点的药物对肝脏损伤和再生的效果。为了考虑代谢综合征的各个方面，在营养缺乏模型中测试的药物同时应在DIO（饮食诱导肥胖）NASH模型中确认[3-5]。

化学诱导模型：典型的肝靶向毒素是四氯化碳（CCl4）、硫代乙酰胺（TAA）、二乙基亚硝胺（DEN）、α-萘异硫氰酸酯（ANIT）和链脲佐菌素（STZ）。不同的化疗毒素模型诱导周期不同，但都较短（1-8周）。CCl4、TAA、ANIT和DEN用于成年小鼠或大鼠，STZ用于新生小鼠（STAM模型）。值得注意的是，有不少研究证明，CCl4或TAA这类化学毒素，可以通过采用不同的造模方式，诱导出来不同的NASH阶段，但机制尚未明确。与营养缺乏模型相比，化学诱导模型同样缺乏临床可译性，并且也导致小鼠体重减轻。目前更多用于抗纤维化治疗的初步验证[4,5]。近年来在临床前药物筛选中用得较多的模型是CCl4结合高脂饮食的模型，动物经较短时间的高脂饮食喂养（8-12周）后开始叠加CCl4，这种方法多因素叠加的方法既缩短时间，也能同时在一个模型上考察NASH和纤维化的效果，但与真正的机制可能存在差别。不过在好的临床前模型如此匮乏的情况下，已经是一个较佳选择[3,5]。

遗传模型：与野生型小鼠模型相比，遗传模型小鼠有更严重的疾病表型以及能在更短时间内经饮食诱导发生NASH。目前常见用于药物临床前研究的有ob/ob和db/db，另外foz/foz、ApoE-/-、LDLR-/-等也有不少报道。这些模型结合致肥胖或营养缺乏模型一起加速NASH和纤维化进展。如ob/ob，瘦素缺陷小鼠，有自发脂肪肝，额外添加西方饮食，可以在较短周期内（8-12周）出现多种病症，较适用于脂肪肝、NASH、血脂异常、肝脏损伤等药物的评价，但不适用于研究治疗肝纤维化药物（据报道瘦素缺乏有利于预防肝纤维化形成）。另外，db/db，瘦素受体缺陷小鼠，在前文中也提到结合MCD饮食的例子[5]。

手术模型：阻断胆汁酸循环的外科手术操作已被作为快速有力诱导实验性肝纤维化的方法。如胆总管结扎术（BDL）是一种梗阻性胆汁淤积模型，手术干预后7-14天即可引发严重的桥接纤维化，如果加长周期，会发展到形成肝结节（肝硬化）。此外，也有一些小鼠胆汁纤维化的非手术模型，包括饮食诱导、化学诱导及遗传模型[6-8]。

理想的NASH模型应该忠实地复制多因素人类疾病机制，同时具有可重复性、高效实用，并且有一定的临床可译性。目前尚没有一个NASH模型能满足所有要求，因此选择模型时应基于对药物靶点的了解，至少使用两个可重现性好的NASH模型来互相补充验证才足以提供药物疗效证据。条件许可情况下，在多个模型中开展药效试验是非常有必要的，因为基于靶点之外，药物的性质和模型的有效性之间的关系尚是个未解之谜，更多的临床前数据对临床推进中精准锁定入组患者会是更有力的支持[8,9]。

研究方案的考量

在FDA机构中，新成立的肝病学和营养学部（DHN）将作为NASH药物研发的审查机构，致力于解决这一关键临床需求的协同工作[27]。其认为，NASH的病程是渐进性的，尤其是肝纤维化的进展需要数年乃至数十年，因此开发治疗药物面临巨大挑战，而患者终生接受治疗的收益需要与药物的安全性相平衡。同时NASH患者易患其他疾病，试验药物不应该加重其他疾病，包括心血管疾病、高脂血症、代谢性疾病、糖尿病和肝损伤等[28]。加速审批的前提是有足够且质控良好的临床试验，并能确定替代终点在药物影响下可以合理预测临床获益。同时，用于验证药物临床获益的上市后研究，也应该在III期临床试验总结数据提交前开展起来。目前，许多非侵入性生物标志物正在研究作为临床实验中的替代标志物，截至目前仍没有任何证据显示无创标志物可以合理预测临床获益的可靠性和一致性，并作为替代疗效终点来加速药物的审批。但监管机构仍鼓励将无创标志物的可靠性和一致性作为研究方向[27]。

关于临床终点，FDA指南将非肝硬化和代偿期肝硬化明确分开，对于中度或桥接纤维化NASH患者（F2和F3），肝穿组织学病理表现可以作为治疗终点加速审批过程，包括：NASH缓解（炎症0-1分，气球样变0分，脂肪变不增加），纤维化不恶化；或改善至少一级纤维化，NASH不恶化；或两者兼有。在指南草案中，提出对于F2和F3期纤维化的NASH患者，组织学终点是可靠的、一致性较好的替代终点，可以较为合理的预测临床获益。同时，尽管有公认的局限性，但由经验丰富的肝脏病理学家读片的肝脏组织学仍是F2或F3期纤维化分级的金标准。对于肝硬化患者（F4），只有传统审批途径，临床终点包括评价腹水，肝性脑病，静脉曲张出血，MELD评分恶化≥15，肝移植率和全因死亡率等[29-30]。

前文提到了NAFLD疾病的异质性，这同样需要在临床方案设计时进行综合考量。目前，NAFLD临床试验数目已有超过百余项[31]。然而不幸的是，应答率仍然很低，只有小于20-30%的参与者显示NASH消退和纤维化消退。低应答率可能归因于许多因素，包括选择人群的异质性，缺乏基于潜在主导驱动因素的分类以及安慰剂效应[32]。因此，现有标准临床试验设计方案的最佳选择是考虑疾病异质性。未来的临床试验设计一旦了解了某些特征与治疗目标之间的关系，试验设计将可能针对具有特定特征的患者，包括性别、激素状况、遗传倾向、代谢和微生物群特征以及是否存在共病症状来进行。这种临床试验设计方案也可能包括合理的组合式方法[25]。代谢相关脂肪肝患者的较大异质性和目前临床试验设计中对研究目标的有限反应意味着需要创新的试验设计。为了克服这些挑战，有人提出了伞型、篮子型和适应性设计等临床设计方案[33-34]。当然，这样的设计增加了临床试验分析的复杂性。

总结

NASH已被视为代谢性疾病领域的头号难题，极大地威胁人类健康，截至目前仍没有药物获批上市。NASH新药开发面临着许多方面的挑战，疾病本身复杂的发病机理、转化困难的临床前动物模型、诸多局限的临床研究，都是我们亟待跨越的障碍。近年来，随着临床试验不断传出坏消息，人们对NASH新药研发的热情也有所减退。原创性新药开发道阻且长，失败亦是常态。相信随着我们对疾病理解的发展，假以时日，NASH会是一个可控的慢性疾病。

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作者简介：郑晓敏，女，硕士，药理学

通信联系人：张雷，男，博导，化学药物开发、医药生物学. E-mail: lzhangce@scut.edu.cn