氧化三甲胺作为细胞冻存保护剂的研究 #

睢晓洁，潘超，杨静，齐海山，张雷**

（天津大学化工学院，天津市 300350）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350;Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350;Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350;Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350;Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350天津大学化工学院，天津市 300350;天津大学化工学院，天津市 300350;天津大学化工学院，天津市 300350;天津大学化工学院，天津市 300350;天津大学化工学院，天津市 300350300350;;;;30035013302133208;;;;1350203801513302133208;;;;13502038015天津市津南区海河教育园区雅观路135号天津大学（北洋园校区）54楼E334;;;;天津市津南区海河教育园区雅观路135号天津大学（北洋园校区）54楼E329sui_xiaojie@tju.edu.cn;panchao0719@163.com;Jing_yang@tju.edu.cn;hsqi@tju.edu.cn;lei_zhang@tju.edu.cn睢晓洁（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向：生物化工;;;;张雷(1980-)，男，博导，主要研究方向：生物化工、生物材料睢晓洁;潘超;杨静;齐海山;张雷SUI Xiaojie;PAN Chao;YANG Jing;QI Haishan;ZHANG Lei张雷高等学校博士学科点专项科研基金（20130032120089）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*ASGHAR W, RAMI A , SHAFIEE H, et al. Preserving human cells for regenerative, reproductive, and transfusion medicine[J]. Biotechnology Journal, 2014, 9(7):895–903.<CR>2*|*期刊*|*YANG J, ZHU YN, XU T, et al. The preservation of living cells with biocompatible microparticles[J]. Nanotechnology, 2016, 27(26):265-101.<CR>3*|*期刊*|*HUANG H, CHOI J K, WEI R, et al. Alginate Hydrogel Microencapsulation Inhibits Devitrification and Enables Large-Volume Low-CPA Cell Vitrification[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(44):6939–6850.<CR>4*|*期刊*|*KARLSSON JOM, TONER M. Long-term storage of tissues by cryopreservation: critical issues[J]. Biomaterials, 1996, 17(3):243-56.<CR>5*|*期刊*|*AITA K, IRIE H, TANUMA Y, et al. Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitoneal administration of dimethyl sulfoxide (DMSO)[J]. Experimental & Molecular Pathology, 2005, 79(3):265-271.<CR>6*|*期刊*|*PAL R, MAMIDI M K, Das A K, et al. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells[J]. Archives of Toxicology, 2012, 86(4):651-661.<CR>7*|*期刊*|*SHU Z, HEIMFELD S, GAO D. Hematopoietic SCT with cryopreserved grafts: adverse reactions after transplantation and cryoprotectant removal before infusion[J]. Bone Marrow Transplantation, 2014, 49(4):469-76.<CR>8*|*期刊*|*MERYMAN H T. Cryopreservation of living cells: principles and practice[J]. Transfusion, 2007, 47(5):935-45.<CR>9*|*期刊*|*UFNAL M, ZADLO A, OSTASZEWSKI R. TMAO, a small molecule of great expectations[J]. Nutrition, 2015, 31(11-12):1317–1323.<CR>10*|*期刊*|*COOPMAN K. Large-scale compatible methods for the preservation of human embryonic stem cells: Current perspectives[J]. Biotechnology Progress, 2011, 27(6):1511-1521.<CR>11*|*期刊*|*FAHY G M, LEVY D I, ALI S E. Some emerging principles underlying the physical properties, biological actions, and utility of vitrification solutions[J]. Cryobiology, 1987, 24(3):196-213.<CR>12*|*期刊*|*YANG J, CAI N, ZHAi H, et al. Natural zwitterionic betaine enables cells to survive ultrarapid cryopreservation[J]. Scientific Reports, 2016, 6.<CR>13*|*期刊*|*ROWLEY S D, ANDERSON G L. Effect of DMSO exposure without cryopreservation on hematopoietic progenitor cells[J]. Bone Marrow Transplantation, 1993, 11(5):389-93.<CR>14*|*期刊*|*GILKEY J C, Staehelin L A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure[J]. Journal of Electron Microscopy Technique, 1986, 3(2):177–210.<CR>15*|*期刊*|*TEFT WA, MORSE, BL, LEAKE, BF, et al. Identification and Characterization of Trimethylamine‑N‑oxide uptake and Efflux Transporters[J]. Molecular Pharmaceutics, 2017, 14(1):310-318.氧化三甲胺作为细胞冻存保护剂的研究|The application of trimethylamine oxide (TMAO) in cell cryopreservation|高等学校博士学科点专项科研基金（20130032120089）|1|睢晓洁|SUI Xiaojie|天津大学化工学院，天津市 300350|Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350|睢晓洁（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向：生物化工|天津市津南区海河教育园区雅观路135号天津大学（北洋园校区）54楼E334|300350|sui_xiaojie@tju.edu.cn|13302133208|13302133208<CR>|2|潘超|PAN Chao|天津大学化工学院，天津市 300350|Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350||||panchao0719@163.com||<CR>|3|杨静|YANG Jing|天津大学化工学院，天津市 300350|Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350||||Jing_yang@tju.edu.cn||<CR>|4|齐海山|QI Haishan|天津大学化工学院，天津市 300350|Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350||||hsqi@tju.edu.cn||<CR>*|5|张雷|ZHANG Lei|天津大学化工学院，天津市 300350|Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350|张雷(1980-)，男，博导，主要研究方向：生物化工、生物材料|天津市津南区海河教育园区雅观路135号天津大学（北洋园校区）54楼E329|300350|lei_zhang@tju.edu.cn|13502038015|13502038015

摘要：以天然渗透压调节剂氧化三甲胺（TMAO）作为超低温冻存保护剂，采用超速冷冻方法对两种模型细胞—人肺癌细胞（GLC-82）以及人宫颈癌细胞（Hela）进行超低温保存。差示扫描量热（DSC）测试表明，TMAO可以显著降低水溶液的冰点，抑制冰晶生成，有利于保护细胞免受冰晶损伤；细胞毒性测试结果表明，细胞在添加1% TMAO的细胞培养液中浸泡3天后，未观察到细胞受到毒性损伤；细胞冻存测试表明，当TMAO浓度为6%（w/v，TMAO/培养基）时，冻存效果最优，GLC-82细胞与Hela细胞的复苏成活率分别达到64%和41%。

关键词：氧化三甲胺；细胞冻存保护剂；超速冷冻保存；差示扫描量热技术

中图分类号：Q28

The application of trimethylamine oxide (TMAO) in cell cryopreservation

SUI Xiaojie, PAN Chao, YANG Jing, QI Haishan, ZHANG Lei

(Chemical Engineering and Technology School, Tianjin University, 300350)

Abstract: The natural osmolyte trimethylamine oxide (TMAO) was tested as a novel cryoprotectant to cryopreserve two types of model cells (GLC-82 cells and Hela cells) with an ultra-rapid freezing protocol. The differential scanning calorimetry (DSC) tests revealed that TMAO had a strong ability to decrease the freezing point of aqueous solution, indicating its strong inhibition to water crystallization, which could protect cells from ice injury. The cytotoxicity assay suggested that TMAO was nontoxic when we exposed GLC-82 cells to 1% TMAO solution for three days. Furthermore, at the optimal concentration of TMAO, the post-thaw viability of GLC-82 cells and Hela cells could reach 64% and 41%, respectively. In conclusion, TMAO could potentially be a nontoxic and high efficient cryoprotectant for cell storage, transportation, as well as clinical cell therapy.

Key words: cell biology; cell cryopreservation; cryoprotectant; trimethylamine oxide; ultra-rapid freezing; differential scanning calorimetry

引言

随着活细胞（如内皮细胞，干细胞，免疫细胞等）在药物筛选、细胞诊断、细胞治疗等领域的应用日益广泛，活细胞的保存与运输越来越受到人们的关注[1,2]。超低温细胞冻存技术是一种可以暂停细胞代谢从而实现长期保存细胞的手段，已广泛应用于细胞相关的各个研究领域[3]。超低温冻存过程不可避免地会导致冰晶形成，从而使细胞受到致命性的机械损伤（冰晶损伤）以及溶质损伤（渗透压损伤）[4]。因此，超低温冻存细胞时必须加入冻存保护剂以使细胞免受低温损伤。二甲基亚砜（DMSO，图1a）是目前应用最广泛的细胞冻存保护剂。但是，DMSO作为细胞冻存保护剂存在几个问题：（1）DMSO具有细胞毒性，它可通过干扰细胞代谢、酶活性、细胞周期等影响细胞的生长和功能，甚至导致细胞死亡[5,6]；（2）在细胞治疗中，使用DMSO冷冻保存过的细胞可能会引起病人诸多的临床副反应，如过敏、胃肠不适等[7]；（3）使用DMSO冻存细胞时需要采用梯度降温的方法，即冻存样品需在不同温度的冰箱（如4℃、-20℃、-80℃）中分别放置一定时间后转移至液氮罐中，过程繁琐，耗时费力[8]。

因此，开发新型的高效无毒冻存保护剂以替代传统的有毒冻存保护剂，已成为各种活细胞应用领域的共性需求。氧化三甲胺（TMAO，图1b）是一种天然的有机小分子，广泛存在于多种动植物体内，具有维持细胞体积并调节细胞渗透压的功能。例如，研究表明，肾脏通过积累TMAO来调节肾髓质细胞渗透压，使其免受高浓度尿素带来的损伤 [9]。因此，TMAO有可能减少或避免细胞在超低温冻存过程中受到的溶质损伤。同时，TMAO是一种两性离子分子，其极性基团与水分子有很强的相互作用，影响水分子间的氢键作用，从而抑制冰晶形成。因此，TMAO的自身性质表明其具有作为细胞冻存保护剂的潜力。本研究首次将氧化三甲胺作为细胞冻存保护剂，以超速冷冻方法探究其对细胞的冻存保护效果。

图1 DMSO （a）、TMAO （b） 分子结构

Fig 1. The molecular structure of DMSO (a) and TMAO (b)

材料与方法

实验材料与仪器

实验试剂与材料

RPMI 1640培养基、LIVE/DEAD 细胞活性/细胞毒性试剂盒购自Life technology；澳大利亚来源胎牛血清购自天津艾克泽生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS磷酸缓冲液粉末、青链霉素混合液、二甲基亚砜购自北京索莱宝公司；无水氧化三甲胺购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

实验仪器

生物安全柜（Biobase，BCD-452WDPF）；倒置荧光显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse Ti-s）；2ml冻存管（Corning，430659）；液氮罐（美国，MEXC47/11）；0.22μm滤膜（Millex，SLGP033RB）；坩埚（上海菁仪化工材料有限公司，Φ5.4×2.0mm）；差示扫描量热仪（瑞士梅特勒多利多，1/500）。

实验方法

差示扫描量热测试

分别配制浓度为0.25、0.50、0.75、1.0、1.25M TMAO水溶液和DMSO水溶液备用，使用差示扫描量热仪测量以上溶液的冰点。调节氮气流速为50ml/min，空气流速为200ml/min，用精密天平称取5-10mg溶液于坩埚中，压片后置于样品池中。设置起始温度为10℃，降温速率为-10℃/min，降温至-50℃后维持5min，设置升温速率为2℃/min，升温至终止温度10℃。

细胞毒性测试

分别取含1% TMAO（w/v）及1% DMSO（v/v）的RPMI 1640培养基1ml于15ml无菌离心管中，加入1×106个GLC-82细胞，用新鲜培养基作为空白对照。放入37℃，5% CO2培养箱中进行悬浮培养，分别在第1，2，3天计算细胞存活率以及测试细胞的贴壁能力。

细胞的超速冷冻及复苏

以含10%（v/v）胎牛血清的RPMI 1640培养基作为载体溶液，分别配制TMAO浓度为1%、2%、4%、6%、8%、10%（w/v）的冻存保护液，以 10%（v/v）DMSO作为对照组，载体溶液作为空白对照组。冻存保护液过滤除菌后，在冻存管中加入1.5ml冻存保护液与1×106个GLC-82或者Hela细胞，迅速置于液氮中冻存过夜。

将冻存管从液氮中取出后快速置于37℃恒温水浴锅中化冻，之后将其快速转移至细胞培养基中进行复苏。

细胞复苏成活率试验

使用LIVE/DEAD 细胞活性/细胞毒性试剂盒对细胞进行染色。在96孔板中加入100μl的钙黄绿素-AM/红色乙锭二聚体-1染液，放置于避光盒中备用。取20μl复温后的细胞悬液加入到含有染液的96孔板中，常温避光条件下孵育30分钟，每组均为三个平行样。在倒置荧光显微镜下对活细胞（绿色）、死细胞（红色）进行计数，计算细胞复苏成活率。

细胞贴壁能力测试

以载体溶液和10% DMSO冻存保护液为对照组，6% TMAO冻存保护液为实验组。将复苏后的细胞悬液加入到无菌12孔板中，置于5%CO2，37℃细胞培养箱中培养，观察细胞复苏48h后的贴壁情况。

结果与讨论

TMAO对冰晶形成的影响

在细胞超低温冻存的降温过程中，细胞通常会受到机械损伤以及溶质损伤，这两种损伤的发生程度与降温速率相关。在梯度降温条件下，胞外冰晶首先形成，并造成细胞内外渗透压失衡，细胞水分逐渐转移至胞外，从而使细胞受到由于胞内电解质浓度升高带来的溶质损伤。而在快速降温条件下，胞内冰晶的形成会通过机械力的方式破坏细胞的超微结构尤其是细胞膜的完整性，从而使细胞受到机械损伤。如果能够抑制细胞在冻存过程中冰晶的形成，将会极大地减弱甚至消除细胞因冰晶形成所致的机械损伤和溶质损伤[10]。

水分子间的相互作用与冰晶的形成和生长有着密切的联系，因此冻存保护剂一般为亲水性分子。TMAO是一种两性离子分子，其极性基团可通过溶剂化作用与水分子结合，从而影响水分子间的相互作用。为探究TMAO对冰晶形成的影响，本文采用差示扫描量热技术测量了不同浓度TMAO水溶液（图2a）和DMSO水溶液（图2b）热流-温度曲线图。

图2a 表明，与纯水相比，随着TMAO浓度增大，其水溶液的熔融峰左移，且熔融峰面积越来越小，即TMAO浓度越大，熔融温度越低。DMSO水溶液也出现类似的实验结果（图2b）。图2c为不同浓度TMAO水溶液和DMSO水溶液的冰点，结果表明，当水溶液浓度在0-0.75mol/l范围内，随着TMAO和DMSO浓度的升高，二者的水溶液冰点均出现了下降趋势，且二者降低溶液冰点的能力相差不大。但当浓度超过0.75mol/l时，TMAO水溶液的冰点则显著低于DMSO水溶液的冰点，说明在此浓度范围，TMAO抑制冰晶形成的能力更强。 从分子结构式的角度来看，冻存保护剂一般有甲基类冻存保护剂（如DMSO）和羟基类冻存保护剂（如海藻糖）。Fahy认为甲基类化合物之间无相互作用，只与水发生键合，而羟基类化合物除了与水发生键合，自身也会发生键合。由于在超低温冻存过程中，羟基化合物自身的键合减少了与水分子之间的键合机会，因此甲基类冻存保护剂对冰晶的抑制效果要强于羟基类冻存保护剂[11]。TMAO与DMSO均为甲基类化合物，DSC测试表明，TMAO具有与DMSO相近甚至更强的降低冰点的能力，即TMAO可以有效地抑制冰晶的形成，可帮助减缓因冰晶形成对细胞造成的机械损伤与溶质损伤。

图2 差示扫描量热测试

Fig.2 Differential scanning calorimetry tests

细胞毒性试验

目前最常使用的冻存保护剂（如DMSO）存在细胞毒性，会对细胞功能造成损伤，如细胞膜损伤，酶活降低，细胞增殖能力受损等[12]，这些损伤可能会导致细胞贴壁能力的降低甚至丧失。因此，本研究将GLC-82细胞浸泡于1% TMAO和1% DMSO的细胞培养液中培养1到3天，而后通过考察细胞的成活率及贴壁能力来测试TMAO与DMSO的细胞毒性。1，2，3天的细胞活死染色结果（图3a）及复苏成活率的统计结果（图3b）表明，细胞在1% DMSO浸泡1天后出现聚集现象 [13]，随着培养时间增加，细胞聚集现象更严重。然而空白对照组以及1% TMAO组细胞均分散良好，细胞未出现聚集。当浸泡2天后，1% DMSO组细胞成活率出现下降趋势，而1% TMAO组与对照组的细胞成活率未有明显的下降。浸泡3天后，贴壁实验结果（图3c）显示，空白对照组与1% TMAO组细胞贴壁密度无明显差异，而1% DMSO组细胞贴壁密度明显低于空白对照组与1% TMAO组，说明细胞在1% DMSO细胞培养液浸泡3天后，与细胞贴壁功能相关的分子可能受到损伤。

注：(a)、(c)比例尺为100μm

图3 细胞毒性测试

Fig.3 cytotoxicity tests

超速冷冻方法下细胞复苏成活率

超速冷冻方法是指将待保存的样品加入冻存保护剂后直接置于液氮中，以实现快速降温保存。相比于传统的梯度冻存方法，超速冷冻方法具有省时、简便、经济等优点[14]。但是传统的冻存保护剂（如10% DMSO）需要较长时间才能充分进入细胞内部，对细胞形成胞内保护，因此在快速降温条件下其对细胞的冻存保护作用差。虽然提高冻存保护剂的浓度可以加快其进入胞内的渗透速率，但同时也会加重冻存保护剂对细胞的毒性损伤程度。

本研究对两种模型细胞（GLC-82细胞和Hela细胞）进行超速冷冻保存，37℃水浴复苏后，用荧光染色的方法（图4a，b）测试其复苏成活率，其中绿色是活细胞，红色是死细胞。GLC-82细胞复苏成活率结果（图4c）表明，在超速冷冻条件下，以TMAO作为冻存保护剂，当其浓度为6%时，细胞复苏成活率达到64%；以目前常用的10% DMSO作为冻存保

注：(a)、(b)、(c)、(d)中比例尺为100μm

图4 细胞冻存测试

Fig.4 Cryopreservation tests

护剂，GLC-82细胞的复苏成活率只有38%，说明在快速降温条件下，DMSO浓度为10%时，其未能充分进入细胞内部对细胞形成胞内保护，而TMAO浓度为6%时就可以快速进入细胞内部以保护细胞免受损伤。研究表明，TMAO通过阳离子转运蛋白OCT2进入细胞[15]，而DMSO则需通过渗透作用进入细胞。因此，我们可以推断在超速冻存条件下，TMAO与DMSO进入细胞的方式的不同导致二者对细胞的冻存保护作用存在差异。同样地，对于Hela细胞，以TMAO作为冻存保护剂时，浓度为6%时冻存效果最好，复苏成活率可以达到41%，而10% DMSO组的复苏存活率仅有5%。故实验结果表明，将细胞直接置于液氮进行超速冷冻时，TMAO对GLC-82、Hela细胞的冻存保护效果显著优于DMSO，且所需浓度更低。

细胞功能测试

为验证冻存复苏后的成活细胞是否具有正常的细胞功能，我们分别对冻存复苏后的GCL-82细胞与Hela细胞进行贴壁实验，48h后观察实验结果。GCL-82细胞贴壁结果（图5a）表明，空白对照组与10% DMSO组GLC-82细胞贴壁数量非常少，且形态与未经过冻存的正常GLC-82细胞有较大差别，说明在超低温冻存过程中，如果不添加冻存保护剂或者以DMSO为冻存保护剂时，细胞受到了显著的低温损伤。6% TMAO组细胞贴壁数量较多且贴壁状态较好，说明以TMAO为冻存保护剂时，其可以有效地维持细胞正常形态和功能。 Hela细胞的贴壁结果（图5b）表明，空白对照组与10% DMSO组的Hela细胞几乎全部死亡，未发现贴壁细胞； 6%TMAO组Hela细胞正常贴壁，且形态良好。以上结果表明以TMAO作为冻存保护剂时，冻存复苏后的成活细胞可以维持正常的细胞形态以及贴壁功能。

注：（a）、(b)中比例尺为100μm

图5 细胞贴壁测试

Fig.5 Phase contrast images of cells adhesion tests

结论

本文以天然渗透压调节剂氧化三甲胺作为超低温细胞冻存保护剂，探究了在超速冷冻保存条件下，氧化三甲胺对两种模型细胞（GLC-82细胞和Hela细胞）的保护作用。结果表明，氧化三甲胺对细胞具有良好的冻存保护作用，且安全无毒，为细胞的保存、运输以及治疗性细胞(如干细胞、免疫细胞等)安全应用于临床治疗提供有力支持。

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基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130032120089）

作者简介：睢晓洁（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向：生物化工

通信联系人：张雷(1980-)，男，博导，主要研究方向：生物化工、生物材料. E-mail: lei_zhang@tju.edu.cn