BC@Laccase消减材料的制备及其对氯酚类有机物的去除性能和影响因素研究#

徐素芹1，鲁慧娟1，刘胜2，陈彬3，张勇1**

（1. 浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018；
2. 北京林业大学理学院，北京 100083；
3. 天津市昌维生物科技有限公司，天津 300300）

2.02.02.02.02.02.02.0College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China；College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China；College of Science, Beijing forestry University, Beijing 100083, China；Tianjin Changwei Biotech Co. Ltd, Tianjin 300300, China；College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018;浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018;北京林业大学理学院，北京 100083;天津市昌维生物科技有限公司，天津 300300;浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018310018;;;;31001818358151064;;;;1876813134618358151064;;;;18768131346浙江省杭州市江干区浙江理工大学24号楼205;;;;浙江省杭州市江干区浙江理工大学24号楼20518358151064@163.com;1045055744@qq.com;lshlxc@163.com;apmp@163.com;zhangyong@zstu.edu.cn徐素芹（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向：生物基水处理材料;;;;张勇（1980-），男，副教授，主要研究方向：生物基水处理材料徐素芹;鲁慧娟;刘胜;陈彬;张勇XU Suqin;LU Huijuan;LIU Sheng;CHEN Bin;ZHANG Yong张勇国家自然科学基金项目（61571002）；浙江省公益技术应用研究项目（2017C31034）；浙江省基础公益研究计划项目（LGF18C160002）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*QIU X, QIN J, XU M, et al. Organic-inorganic nanocomposites fabricated via functional ionic liquid asthe bridging agent for Laccase immobilization and its application in 2,4-dichlorophenol removal[J]. 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Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31(7): 907-931.BC@Laccase氯酚类有机物消减材料制备及其性能评价|Preparation and evaluation of BC@Laccase subtractive materials for chlorophenolic organics|国家自然科学基金项目（61571002）；浙江省公益技术应用研究项目（2017C31034）；浙江省基础公益研究计划项目（LGF18C160002）|1|徐素芹|XU Suqin|浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018|College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China|徐素芹（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向：生物基水处理材料|浙江省杭州市江干区浙江理工大学24号楼205|310018|18358151064@163.com|18358151064|18358151064<CR>|2|鲁慧娟|LU Huijuan|浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018|College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China||||1045055744@qq.com||<CR>|3|刘胜|LIU Sheng|北京林业大学理学院，北京 100083|College of Science, Beijing forestry University, Beijing 100083, China||||lshlxc@163.com||<CR>|4|陈彬|CHEN Bin|天津市昌维生物科技有限公司，天津 300300|Tianjin Changwei Biotech Co. Ltd, Tianjin 300300, China||||apmp@163.com||<CR>*|5|张勇|ZHANG Yong|浙江理工大学材料科学与工程学院，杭州 310018|College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China|张勇（1980-），男，副教授，主要研究方向：生物基水处理材料|浙江省杭州市江干区浙江理工大学24号楼205|310018|zhangyong@zstu.edu.cn|18768131346|18768131346

摘要：针对游离漆酶（Laccase）稳定性差、重复利用率低等问题，采用戊二醛交联法将漆酶固定于细菌纤维素（BC）基材上。通过优化制备工艺，制备环境友好、循环使用的BC@Laccase氯酚类有机物消减材料，利用扫描电镜、傅里叶变换红外光谱仪及热重分析仪对其进行表征，并研究BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚的降解性能。结果表明：在反应时间4 h、反应温度25 ℃、反应pH值3.5条件下得到最优的BC@Laccase消减材料。利用BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚进行降解处理，当介体用量4 mM、处理温度30 ℃、pH值3、处理时间5 h时，降解2-氯苯酚效果最佳，降解率为76.9%。

关键词：细菌纤维素；固定化；漆酶；介体；2-氯苯酚

中图分类号：X522

Study on the removal performance and influencing factors of chlorophenols by preparing BC/Laccase subtractive materials

XU Suqin1, LU Huijuan1, LIU Sheng2, CHEN Bin3, ZHANG Yong1

(1. College of Materials Science and Engineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;
2. College of Science, Beijing forestry University, Beijing 100083, China;
3. Tianjin Changwei Biotech Co. Ltd, Tianjin 300300, China)

Abstract: To solve the problems of poor stability and low reuse rate of free laccase, it was fixed on bacterial cellulose (BC) substrate by glutaraldehyde crosslinking method. By optimizing the preparation process, the environmentally friendly and recyclable BC@Laccase chlorophenol organic subtractive material was prepared. It was characterized by scanning electron microscope, fourier transform infrared spectrometer and thermogravimetric analyzer. This material was applied to the treatment of 2-chlorophenol. The results showed that the best BC@Laccase subtractive materials were prepared at the special condition that the reaction time was 4 h, reaction temperature was 25 ℃ and reaction pH value was 3.5. The BC@Laccase subtractive material was used to degrade 2-chlorophenol under the optimal conditions. The best degradation effect was obtained at the medium dosage was 4 mM, the treatment temperature was 30 ℃, the pH value was 3, and the treatment time was 5 h. At this condition, the degradation rate reaching 76.9%.

Key words: bacterial cellulose; immobilization; laccase; medium; 2-chlorophenol

修改了中英文题目及第10行“可循环利用”修改为“循环使用”

引言

氯酚类有机物是一类非常重要的工业中间体[1-2]，被广泛用于有机化合物的合成及农药的生产。大多数氯酚类化合物具有环境稳定性、生物累积性和生物毒性，严重危害人类健康及生态安全，在排放之前必须从水体中去除[3-5]。目前，我国环保部门已将2-氯苯酚列为氯酚类化合物中的优先控制污染物。2-氯苯酚是重要的有机合成原料，也是用于医药、农药和染料等工业生产的中间体，属于“三致”（致畸、致癌、致突变）物质，将其从水体中去除非常必要。目前处理方法主要有电化学法、臭氧法[6]和光催化法等，但这些方法操作复杂且会产生二次污染。

漆酶是一种多组分氧化酶，能氧化酚类、氯酚类、芳香胺类及一些无机化合物[7]，其在处理水体污染物中表现出操作简单、催化效率高且无二次污染等显著优点[8-9]，可作为绿色催化剂用于水处理[10]、染料脱色[11]和土壤生物修复[12]等方面。但是，游离形式的漆酶也存在较多局限性，如稳定性差、重复利用率低、生产成本高[13-14]等。为克服这些缺点，可对其采用固定化技术，通过酶固定化提高漆酶的稳定性和重复利用率，降低处理成本。

细菌纤维素（BC）是由特定细菌产生的一种独特形式的纤维素，具有良好的机械性能、超细微的三维网状结构和优异的吸水能力等特点[15]，可将其作为固定漆酶的载体。同时，人们发现某些介体能够有效提高漆酶的降解效率，这类介体容易得失电子，迅速被漆酶氧化形成活性高且稳定的中间体，作用于底物使其被催化氧化[16]。

为此，基于2-氯苯酚的危害、漆酶的催化优势以及细菌纤维素作为载体的特性，本研究以2-氯苯酚模拟水体中的氯酚类有机污染物，以芥子酸作为漆酶介体，通过酶固定化技术将漆酶固定于BC，优化制备BC固定漆酶氯酚类有机物消减材料（BC@Laccase），评价BC@Laccase消减材料对水体中2-氯苯酚的降解性能。

实验

实验材料

醋酸杆菌CGMCC 1.1812购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；葡萄糖（AR）、酵母浸粉（UP）、柠檬酸钠（98%）、硫酸镁（AR）、醋酸钠（AR）、冰乙酸（AR）、戊二醛（AR）、2-氯苯酚（AR）、4-氨基安替比林（98%）、氯化铵（AR）、芥子酸（98%）购自上海阿拉丁化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（AR）购自上海三鹰化学试剂有限公司；蛋白胨（BR）、磷酸氢二钠（AR）、氢氧化钠（AR）、乙酸钠（AR）、氨水（AR）、2, 2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，98%）、铁氰化钾（AR）购自上海麦克林生化科技有限公司；漆酶（PP）购自盈芯生物科技（上海）有限公司。

BC基材培养

将醋酸杆菌置于种子培养基（30 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸粉、10 g/L蛋白胨、1 g/L柠檬酸钠、2 g/L硫酸镁）中，28 ℃ 140 r/min动态培养36 h；按10%接种量转接至发酵培养基（30 g/L葡萄糖、12 g/L酵母浸粉、12 g/L蛋白胨、2 g/L柠檬酸钠、2 g/L硫酸镁、2.7 g/L 磷酸氢二钠、2 g/L磷酸二氢钾），28 ℃静态培养7 d。上述种子培养基和发酵培养基置于高压灭菌锅中120 ℃灭菌20 min，经冷却后使用。

将发酵培养基表面悬浮BC膜取出，清水缓慢冲洗，去除膜表面菌体及残留培养基成分；置于0.1 mol/L氢氧化钠溶液中，70 ℃水浴至BC膜呈白色半透明状取出；去离子水冲洗后置于1%乙酸中浸泡10 min，用去离子水反复冲洗至中性；将其置于超低温冰箱中预冷冻4 h，放入冷冻干燥机中冷冻48 h，得到BC干膜，即固定漆酶用BC基材。

BC@Laccase制备

将10 mg BC基材浸入2 mL 2.5%戊二醛溶液，搅拌1 h使其充分反应；再将其置于10 mL漆酶溶液（0.5 mg/mL）中，一定温度下温育20 min；于4 ℃静止吸附一段时间。研究吸附时间、温度及环境pH对BC@ Laccase消减材料酶活的影响。

BC@Laccase性能评价

将BC@Laccase消减材料置于的2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L）200 r/min下降解一段时间，通过改变介体用量、降解温度、pH值及降解时间确定最佳降解效果。采用4-氨基安替比林法，于最大吸收波长510 nm处测定2-氯苯酚的吸光度，经换算计算其降解率。

分析方法

漆酶酶活测定

反应体系由0.5 mM ABTS、100 mM乙酸钠缓冲和BC@Laccase消减材料组成。将10 mg BC@Laccase消减材料加入到3 mL 0.5 mM ABTS中，室温温育5 min。采用紫外分光光度法于420 nm（ε= 3.6×104 M-1cm-1）处测定其上清液吸光度变化值。酶活单位定义为每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量，并将每组活性最高的数据定义为100%，以相对酶活进行计算。其计算公式如式（1）：

（1）

其中：V总为反应体系总体积，mL；m载体为固定化酶载体的质量，mg。

米氏常数测定

游离漆酶和固定化漆酶的动力学参数（Km和Vmax）是在不同底物浓度（0.2-1 mM）下分别测定其对应催化ABTS的反应初速度，通过米氏方程计算，计算公式如式（2）：

（2）

其中：Vmax为最大反应速率；Km为米歇利斯常熟；[S]为底物浓度。

通过Lineweaver-Bruk双倒数作图求解Km和Vmax。将米氏方程写成倒数形式（3），即Y=aX+b方程的形式，以1/V对1/[S]作图，Y轴的截距即1/V。

（3）

2-氯苯酚降解率测定

在pH值为10±0.2时，铁氰化钾为氧化剂，4-氨基安替比林与酚类化合物反应生成红色安替比林染料。取10 mL反应液，依次加入200 μL氨水缓冲液、100 μL 4-氨基安替比林和100 μL铁氰化钾，于最大吸收波长510 nm处测定2-氯苯酚吸光度。计算公式如式（4）：

（4）

其中：η为2-氯苯酚的降解率，%；C0为反应前2-氯苯酚溶液的初始浓度，mg/L；Ce为反应后2-氯苯酚溶液的残余浓度，mg/L。

BC@Laccase结构表征

扫描电子显微镜观察

将BC基材及BC@Laccase消减材料贴于导电胶上镀金，在工作电压3 kV下，采用JSM-5610LV型场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析BC基材以及BC@Laccase消减材料的表面形貌。

红外光谱表征

采用 Nicolet 5700型傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）分析BC基材和BC@Laccase消减材料的化学结构，用溴化钾压片法进行测试，扫描范围4000~500 cm-1，分辨率4 cm-1。

热重分析

采用热重分析仪（TG）分析游离漆酶及BC@Laccase消减材料的热稳定性，在N2气氛保护下进行测试，以10 ℃/min升温速率从常温升至600 ℃。

结果与讨论

固定化工艺优化

时间对漆酶固定化的影响

如图1所示，考察BC@Laccase消减材料酶活随着固定化时间的变化情况。在4 h之前，固定化酶量较少，BC@Laccase消减材料的活性较低。4 h后相对活性显著降低，可能是随着时间增加，交联剂的存在导致漆酶灵活性下降，漆酶的灭活量也逐渐增加，漆酶活性降低；可能是随着吸附时间的延长，BC基材上的吸附位点逐渐被占据，相关的位阻和扩散限制也可能导致漆酶活性下降。由图1可知，当固定时间为4 h时，酶活达到最大值，表现出最佳固定化效果。

图1 时间对漆酶固定化的影响

Fig. 1 Effect of time on laccase immobilization

温度对漆酶固定化的影响

如图2所示，考察了固定化过程中温度变化对其酶活的影响。随着反应温度的升高，漆酶酶活先增加后降低。当温度为25 ℃时表现出最大的活性，当温度超过25 ℃后漆酶变得不稳定，可能由于随着温度的升高，在超过一定温度范围后酶蛋白逐渐变性，漆酶失活量增加。Du等分析了多个具有良好热稳定性的真菌漆酶的受氨基酸序列影响，发现从c端延伸出的氨基酸可能维持漆酶的稳定性，而当c端氨基酸发生特异性突变时会使漆酶活性和稳定性发生显著变化[17]。温度过低会在一定程度上抑制漆酶活性，温度过高会使氨基酸发生特异性突变进而致使漆酶失活。

图2 温度对漆酶固定化的影响

Fig. 2 Effect of temperature on laccase immobilization

pH对漆酶固定化的影响

如图3所示，考察了固定化过程中pH变化对其酶活的影响。由于固定化酶载体孔道内部的微环境与外界环境存在一定的差异，外界环境对孔道内的pH起到一定的缓冲作用，因而不同pH值会导致不同的微环境。由3图可知，漆酶在偏酸性的条件下放置较稳定，但溶液酸性较强也会使漆酶失活，当pH<3.5表现漆酶活性偏低。随着pH值的增加，酶的活性也受到了一定的限制，这是因为漆酶周围支撑微环境与载体表面产生的质子有关[18]。BC@Laccase消减材料在pH为3.5时表现出较好的pH适应性，可能是由于在此条件BC@Laccase消减材料结构周围质子保持平衡。

图3 pH对漆酶固定化的影响

Fig. 3 Effect of pH on laccase immobilization

表面形貌观察

如图4所示，以扫描电镜（SEM）对BC基材和BC@Laccase消减材料进行观察。图4（a）为BC基材的SEM图像，可以看出BC基材呈现出相互连接的超细微网状结构，且网状孔径大小不一。由图4（b）可以看出，由于漆酶尺寸较小，BC@Laccase消减材料大部分漆酶粒子吸附在表面并贯穿在BC基材网络中。由于BC基材的纳米机构具有非常精细和相互连接的纤维网络，且漆酶能在BC基材上分布良好，适合作为漆酶的固定化基材。

图4 BC及固定化漆酶材料的FESEM照片：(a) BC基材，(b) BC@Laccase消减材料

Fig. 4 FESEM photos of BC and immobilized Laccase materials :(a) BC substrate, (b) BC@Laccase subtractive material

红外光谱表征

如图5所示，BC基材和BC@Laccase消减材料的傅里叶变换红外光谱图（FTIR）。对于BC基材，FTIR结果证实了3403 cm-1和2899 cm-1处存在O-H和C-H拉伸振动，1651 cm-1处出现一个尖峰，代表纤维素的葡萄糖羰基(C-O)[19]。在1420 cm-1和1363 cm-1处出现了两个重要的峰值，分别表明了C-H的对称变形和弯曲振动[20]。1057 cm-1处是葡萄糖环中的骨架-C-O-C-醚键峰，897 cm-1处是纤维素骨架中的β-1,4-糖苷键。1668 cm-1处出现酰胺键，是蛋白质的结构表征，可以表明漆酶已成功的固定在BC基材上。

图5 BC基材及BC@Laccase红外光谱图

Fig. 5 FTIR spectra of BC substrate and BC@Laccase subtractive material

热重分析

由图6可知，在100 ℃之前，游离漆酶最先开始分解，主要是其本身含有的水分先流失。从热重分析图可以得出：游离漆酶和BC@Laccase消减材料主要在250-400 ℃范围内进行热分解；游离漆酶的开始分解温度为250 ℃，BC@Laccase开始分解温度为300 ℃；游离漆酶的最大热降解温度在330 ℃，BC@Laccase的最大热降解温度在380 ℃。这种现象归因于分解温度在250 ℃之前，主要是纤维素分子内的结晶区受到破环，使其先分解；分解温度在250 ℃之后，主要是酰胺键在一定程度上增加其稳定性，使其分解温度增高，可以表明BC@Laccase热稳定性明显高于游离漆酶。

图6 BC基材及BC@ Laccase热重分析

Fig. 6 Thermogravimetric analysis of BC substrate and BC@Laccase subtractive material

酶学特性表征

米氏常数Km是酶的动力学参数，其值等于酶促反应最大反应速度一半时的酶浓度。Km值只与酶的性质、酶促反应的底物以及反应条件有关，可以反映酶与底物的亲和力大小。Km值越小，酶与底物的亲和力越大。在底物浓度c为0.2-1 mM的ABTS溶液下进行测试，将适量的游离漆酶和BC@Laccase消减材料分别与ABTS溶液反应5 min，于420 nm处测定吸光度变化值，计算酶促反应的初速度V，由Lineweaver-Burk双倒数处理得图7。经计算游离漆酶的Km值为1.018 mM，BC@Laccase消减材料Km值为1.086 mM。漆酶在固定化后米氏常数变大，漆酶与底物间的亲和力降低，这是因为漆酶被固定化后空间位阻增大，底物与漆酶活性中心的接触机率变小。

图7 Lineweaver-Burk双倒数图

Fig. 7 Lineweaver-burk double reciprocal diagram

2-氯苯酚降解性能评价

芥子酸用量对2-氯苯酚降解影响

在温度25 ℃、溶液pH值6、降解时间4 h条件下，考察不同芥子酸用量对2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）的降解影响。由图8可知，BC@Laccase消减材料催化降解2-氯苯酚的降解效果随着芥子酸用量的增加先升高后降低。可能是随着芥子酸用量的增加，易被漆酶氧化的介体增多，故降解率升高；而后由于部分固定化漆酶在氧化过程中逐渐失活，故降解率又降低。当芥子酸用量为4 mM时可达最佳降解效果，降解率为66.3%。

图8 芥子酸用量对2-氯苯酚降解影响

Fig. 8 Effect of erucic acid dosage on degradation of 2-chlorophenol

温度对2-氯苯酚降解影响

在芥子酸含量4 mM、溶液pH值6、降解时间4 h条件下，考察不同温度对2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）的降解效果，结果如图9所示。在25-30 ℃范围内，BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚的降解率呈上升趋势；在30-45 ℃范围内，固定化漆酶对2-氯苯酚的降解率又逐渐下降。当降解温度为30 ℃时，在该温度下2-氯苯酚的降解率最高，降解率为76.4%。由图9可知，BC@Laccase消减材料在较宽的温度范围内对2-氯苯酚降解效果都在73.0%以上，这是因为漆酶被固定化后，空间结构发生变化，温度的变化对固定化漆酶影响变弱。

图9 温度对2-氯苯酚降解影响

Fig. 9 Effect of temperature on degradation of 2-chlorophenol

pH对2-氯苯酚降解影响

在芥子酸含量4 mM、溶液温度30 ℃、降解时间4 h条件下，考察不同pH对2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）的降解影响，结果如图10所示。不同pH存在形式差异，对2-氯苯酚的降解效果影响也很明显。由图10可知，当pH<3时，BC@Laccase消减材料降解率逐渐增加，当pH>3时降解效率迅速降低。当pH为3时BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚的降解效果最佳，降解率为63.3%。

图10 pH对2-氯苯酚降解影响

Fig. 10 Effect of pH on degradation of 2-chlorophenol

时间对2-氯苯酚降解影响

在芥子酸含量4 mM、温度30 ℃、溶液pH值3条件下，考察不同降解时间对2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）的降解效果。由图11可知，在1-5 h范围内，BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚的降解率逐渐增加；在5-6 h范围内降解率急剧下降，可能是由于固定化漆酶对2-氯苯酚降解过程中底物浓度的减少导致，降解产物的累积也会使抑制2-氯苯酚的催化降解。当降解时间为5 h时，BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚达到最佳降解效果，降解率为76.9%。

图11 时间对2-氯苯酚降解影响

Fig. 11 Effect of time on degradation of 2-chlorophenol

操作稳定性

取10 mg BC@Laccase消减材料于芥子酸含量4 mM、温度30 ℃、溶液pH值3、降解时间5 h条件下降解2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L），测定其溶液的吸光度。在BC@Laccase消减材料使用后用缓冲溶液多次冲洗后，重复上述操作。Duran等研究发现固定化漆酶降解水体中的酚类污染物时，产生的不溶物吸附在固定化载体表面，将阻碍酶分子与氯酚分子之间的接触，在反复使用过程中会造成效率下降[21]。由图12可知，经过7次循环操作后，BC@Laccase消减材料的降解率降低11.7%，但仍保持在65.0%以上，表现出较好的稳定性。

图12 2-氯苯酚降解操作稳定性

Fig. 12 Operational stability of 2-chlorophenol degradation

结论

本文以超细微三维网状结构的细菌纤维素作为固定化漆酶的支架，并通过采用戊二醛交联将漆酶固定于BC上，通过优化固定化工艺以制备环境友好、安全高效的BC@Laccase消减材料，应用于水体中的2-氯苯酚的降解，主要结论如下：

a）经单因素优化实验获得最佳固定化工艺：固定时间4 h、温度25 ℃、pH值3.5。

b）游离漆酶的Km值为1.018 mM，BC@Laccase消减材料Km值为1.086 mM，漆酶固定化后米氏常数变大。

c）在2-氯苯酚降解实验中，当芥子酸用量4 mM、温度30 ℃、pH值3、降解时间5 h时，可获得2-氯苯酚最大降解率为76.9%。

d）经7次循环操作后，BC@Laccase消减材料对2-氯苯酚的降解效果保持在最初降解效果的84.8%以上，表明BC@Laccase消减材料具有较好操作稳定性。

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基金项目：国家自然科学基金项目（61571002）；浙江省公益技术应用研究项目（2017C31034）；浙江省基础公益研究计划项目（LGF18C160002）

作者简介：徐素芹（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向：生物基水处理材料

通信联系人：张勇（1980-），男，副教授，主要研究方向：生物基水处理材料. E-mail: zhangyong@zstu.edu.cn