水稻细胞壁相关蛋白及其互作网络的综合分析 #

叶倩男，王一，吴奇，李成云**

（云南农业大学，省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.0State key laboratory of conservation and utilization of biological resources, yunnan agricultural university, kunming 650201, China；State key laboratory of conservation and utilization of biological resources, yunnan agricultural university, kunming 650201, China；State key laboratory of conservation and utilization of biological resources, yunnan agricultural university, kunming 650201, China；State key laboratory of conservation and utilization of biological resources, yunnan agricultural university, kunming 650201, China云南农业大学，省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201;云南农业大学，省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201;云南农业大学，省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201;云南农业大学，省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201650201;;;65020115559809225;;;1370870557515559809225;;;13708705575云南省昆明市盘龙区沣源路云南农业大学;;;云南省昆明市盘龙区沣源路云南农业大学601870489@qq.com;273990249@qq.com;183111061@qq.com;licheng_yun@163.com叶倩男（1995.1），女，植物寄主与病原互作机制;;;李成云，男，博导，分子植物病理学叶倩男;王一;吴奇;李成云YE Qiannan;WANG Yi;WU Qi;LI Chengyun李成云国家重点研发计划资助 (No. 2017YFD0200400)。2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*张素巧, 孙颖, 郭毅, 等. 细胞壁连接的类受体激酶(WAK):植物细胞壁与细胞质联系的重要蛋白[J]. 科学通报, 2006(01):3-9.<CR>2*|*期刊*|*马浩力, 余礼, 梁荣洪, 等. 高等植物阿拉伯半乳糖蛋白的功能研究[J]. 中国科学:生命科学, 2015,045(2):111-123.<CR>3*|*期刊*|*张水军, 曾千春, 卢秀萍, 等. 植物富含甘氨酸蛋白的研究进展[J]. 中国农学通报, 2010, 26(14).<CR>4*|*期刊*|*周晓馥,王景余,王兴智. 植物纤维素合成酶基因的研究进展[J]. 遗传2002:24(3):376-378.<CR>5*|*期刊*|*张合琼, 张汉马, 梁永书, 等. 植物硝酸盐转运蛋白研究进展[J]. 植物生理学报,2016,336(2):4-12.<CR>6*|*期刊*|*Sophie Léran, Varala K , Boyer J C , et al. 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摘要：随着研究技术的迅速发展，人们对植物细胞壁的结构和功能的认识不断加深。利用多种生物信息学方法对水稻全基因组中细胞壁相关蛋白进行分析，可为探索这些较难分离、纯化蛋白质的特点和功能提供重要线索和基础。本研究从最新版的水稻基因组数据库中检索出细胞壁相关的蛋白，其中属于酶类的蛋白主要包含细胞壁相关受体激酶（WAKs）、阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）和纤维素代谢酶类（CMEs），属于非酶类蛋白包括硝酸盐转运蛋白（NPFs）和富甘氨酸细胞壁结构蛋白（GRPs）。对上述各类蛋白进行类别内和类别间的蛋白质互作分析的结果表明，不同类型的类别内蛋白之间互作的模式存在显著差别。细胞壁相关受体激酶与富甘氨酸细胞壁结构蛋白类别内蛋白之间未找到相互作用的蛋白质，阿拉伯半乳糖蛋白和纤维素代谢酶在类别内蛋白之间的部分蛋白存在互作；NPF家族蛋白内多数蛋白之间均有互作；且阿拉伯半乳糖蛋白和纤维素代谢酶两类蛋白之间也存在互作。通过与水稻抗病性调节基因数据库的联合分析，发现上述各类别蛋白中都有抗病性相关的调节蛋白，且都有非寄主抗性蛋白。这些蛋白既是水稻对不同病原菌抗性的重要标记分子，也是功能研究的重要候选蛋白。此外，这些结果表明细胞壁相关蛋白介导的抗病性是水稻非寄主抗性的重要组成，对这些蛋白的深入研究和有效利用可能增强水稻的非寄主抗性，且为进一步通过试验探索这些蛋白的功能及其对细胞壁的深入了解也有重要意义。

关键词：水稻；细胞壁相关蛋白；功能；互作网络；抗病调节蛋白

中图分类号：S432.1

Analysis of rice cell wall related proteins and their interaction networks

YE Qiannan, WANG Yi, WU Qi, LI Chengyun

(State key laboratory of conservation and utilization of biological resources, yunnan agricultural university, kunming 650201, China)

Abstract: With the rapid development of research techniques, the structure and function of plant cell walls have been increasingly understood. The analysis of cell wall related proteins in the whole rice genome by various bioinformatics methods can provide important clues and basis for exploring the characteristics and functions of these proteins which are difficult to isolate and purify. In this study, cell wall related proteins were retrieved from the latest version of the rice genome database. Among them, the enzymatic proteins included cell wall related receptor kinases (WAKs), arabinogalactose proteins (AGPs) and cellulosic metabolic enzymes (CMEs), while the non-enzymatic proteins included nitrate transporter 1 and peptide transporter protein (NPFs) and glycine-rich cell wall structural proteins (GRPs). The results of intra - and inter-group protein interaction analysis showed that there were significant differences in interaction patterns among different group of proteins. There was no interaction within both WAKs and GRPs proteins, and there were interactions within AGPs and DMEs. The interactions among proteins in the NPFs are the most intense. There was also a close interaction among proteins of AGPs and CMEs. To combine with the rice disease-resistance regulatory gene database, it was found that there were regulatory proteins related to disease resistance in all the above groups, many of which were non-host resistant proteins, indicating that many of the disease-resistance mediated by cell wall related proteins belonged to non-host resistance. These results established a foundation for further experiments to explore the functions of these proteins for cell walls and disease resistance.

Key words: Rice; cell wall-related proteins; functions; interaction networks; disease resistance regulation protein

引言

植物细胞壁是包裹在植物细胞表面的一层坚硬而略带弹性的外壳，像骨骼一样支撑着植物细胞，控制细胞的生长、分化及组织的延伸。同时，植物细胞壁也和植物的防御反应相关，是寄主与病原菌互作的重要场所。这些功能的发挥都离不开细胞壁相关蛋白的参与。植物细胞壁相关蛋白在细胞代谢、发育调控、细胞壁成分修饰、细胞内外的信号转导及逆境胁迫响应等过程中均发挥着重要的功能。根据其主要功能域，主要的细胞壁相关蛋白分为5个类别。通过胞外结构域结合大量不同配体，从而接收和传导不同的外界信号刺激的细胞壁相关受体激酶（cell wall-associated kinase，WAKs）[1]；在细胞增殖与生长、细胞分化、细胞程序性死亡、体细胞胚胎发生、花药发育与花粉管生长、合子分裂和胚胎发育等过程中发挥着重要功能的阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGPs）[2]；能对细胞壁中其他组分的分布起到支架作用，并且在植物对低温、干旱、盐渍化等逆境胁迫的响应与适应中发挥着重要作用的富甘氨酸细胞壁结构蛋白（glycine-rich protein, GRPs）[3]；能够决定细胞生长方向及影响细胞壁延展性和弹性的纤维素代谢酶（cellulose metabolic enzyme, CMEs）[4] ；作为协助植物吸收硝酸根离子及小分子多肽的一类转运蛋白，并对中性粒细胞脱颗粒、寡肽转运等过程具有调节作用的NPF家族蛋白（nitrate transporter 1 and peptide transporter protein，NPFs）[5,6]。

STRING是一个收集、评估及整合了众多公用“蛋白－蛋白”互作资源的数据库，并能进一步将计算机预测结果整合进来，为用户提供一个强大的以蛋白质功能互作分析的网络平台，涵盖直接（物理）的互作和间接（功能上）的互作信息[7]。最新版本的STRING 数据库（V.11.0）囊括的物种和蛋白质数量相比之前翻了一番还多，达到 5090个物种的2400多万个蛋白质。支持上传基因组规模的数据集，可以让用户快速地把数据集可视化为互作网络，并对输入的数据做基因富集分析。在富集分析中STRING 不仅整合了 Gene Ontology 和 KEGG等著名的分析系统，还提供了基于高通量文本挖掘的分类系统，及基于数据库本身的关联网络的层级聚类。我们利用STRING对检索到的343个细胞壁相关蛋白进行了类别内和类别间的互作网络分析。为探索这些细胞壁相关蛋白与抗病性的相互关联，我们又将上述数据在最新版的OryGenesDB database（orygenesdb.cirad.fr/）中进行了查询，检索出其中与水稻真菌、细菌、病毒互作时响应的基因。根据Vergne等[8]的整理，这些基因整合了大量试验中发现的与病原菌互作时表达有显著差异的抗病调节基因，其编码的蛋白则为抗性调节蛋白（disease resistance regulation protein）。通过多个数据库的综合分析，我们发现了一些可能在水稻抗病性中发挥重要作用的细胞壁相关蛋白及其互作关系。这些分析结果能为进一步利用试验探索这些蛋白的功能及其对细胞壁的作用奠定基础。

1 材料与方法

水稻细胞壁相关蛋白基本信息均来自于Rice Genome Annotation Project最新版的数据库。从中检索出“cell wall associated genes”的所有基因，获得相关基因的RAP-DB号。根据获得的水稻细胞壁相关蛋白基因注释进行分类后，利用NCBI对水稻细胞壁相关蛋白在染色体上的位置及表达器官、时期进行整理与分析。利用最新的功能蛋白互作网络分析系统STRING（https://string-db.org，v.11.0）对这些蛋白进行类别内及类别间的互作网络分析。使用参数主要包括物种设置（Oryza sativa）使获得信息更为严谨有效，系统默认可信度（中等，0.4），获得类别内及类别间蛋白质互作信息。蛋白之间的互作关系包括融合蛋白、相邻蛋白、蛋白共出现、蛋白共表达、文献数据、数据库数据、实验证据等项[7]。

2.水稻细胞壁相关蛋白的类别

从Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu）中共检索到343个与水稻细胞壁相关蛋白。根据同网站的基因注释可将343个水稻细胞壁相关蛋白分为5个类别。其中细胞壁相关受体激酶及阿拉伯半乳糖蛋白的数量最多，分别为138个，和69个，占细胞壁相关蛋白数量的40.23%和20.12%。其次是富甘氨酸细胞壁结构蛋白及纤维素代谢酶，分别占细胞壁相关蛋白总量的17.49%和12.54%。占细胞壁相关蛋白百分比最少的是NPF家族蛋白，仅为细胞壁相关蛋白总量的9.62%（表1）。

表1 水稻细胞壁相关蛋白的分类信息

Table 1. Rice cell wall related proteins classified information

蛋白质类别 Protein group	蛋白数量 No.of protein	占细胞壁相关蛋白百分比 Percentage of protein (%)	类别内互作蛋白数量 No. of protein within group	抗病调节蛋白数量 No. of disease resistance regulation protein
I. 细胞壁相关受体激酶 I. Cell wall-associated kinase WAKs	138	40.23	2	24
II. 阿拉伯半乳糖蛋白 II. Arabinogalactan proteins (AGPs)	69	20.12	28	11
III. 富甘氨酸细胞壁结构蛋白 III. Glycine-rich protein (GRPs)	60	17.49	0	12
IV. 纤维素代谢酶 IV. Cellulose metabolic enzyme (CMEs)	43	12.54	38	10
V. NPF家族蛋白 V. Nitrate transporter 1 and peptide transporter protein，(NPFs)	33	9.62	27	4
合计 Summary	343	100	95	61

以上基因数据和信息均通过NCBI，Rice Genome Annotation Project下载后统计分析获得

3 水稻细胞壁相关蛋白基本信息

3.1细胞壁相关受体激酶与水稻病原菌响应

细胞壁相关受体激酶（WAK）及类细胞壁相关受体激酶（WAKL）属于植物类受体激酶（receptor-like kinase，RLK）中的一类受体激酶蛋白。植物基因组中存在大量的RLK，拟南芥基因组中达600多个，水稻基因组中则多达1000多个[9])。根据现行版本的水稻基因组注释，共得到138个细胞壁相关受体激酶（表1）。对其在水稻染色体上的分布进行分析，发现这些基因分散在各条染色体上，未出现成簇分布的现象。在String数据库中有100个对应蛋白，根据默认参数分析该类别内蛋白质之间的互作，结果除OsJ_29796(Os09g0482800)与Os02T0807900-01(Os02g0807900)存在共表达外，未发现其它类别内蛋白的互作。其中抗病调节蛋白24个，Os02g0111600等9个为非寄主抗性的调节基因（表2）。

表2 水稻细胞壁相关蛋白基本信息与对病原菌响应

Table 2. Information of rice cell wall related proteins and response to pathogen

蛋白类别 Group	基因号 gene ID	蛋白编号 Protein ID	染色体上位置 location on genome	蛋白大小（aa） Protein size	蛋白家族 Protein family	对水稻病原菌的响应 Response to pathogen
I	Os10g0162400	OS10T0162400-01	4075547..4081739	904	WAK	病原防御基因
I	Os04g0387000	OS04T0387000-00	18061314..18064907	114	WAKL	非寄主抗性
I	Os02g0808300	OS02T0808300-01	34545179..34550259	344	WAK	稻瘟病菌
I	Os04g0366000	OS04T0366000-00	17667793..17671135	701	WAKL	稻瘟病菌
I	Os07g0493800	OsJ_24315	18453572..18462715	677	WAKL	稻瘟病菌
I	Os09g0561482	OS09T0561482-00	10378338..10382014	381	WAKL	稻瘟病菌
I	Os09g0561480	OS09T0561482-01	22292317..22295153	345	WAK	稻瘟病菌
I	Os09g0562600	not found	22348450..22351523	802	WAK	稻瘟病菌
I	Os10g0180800	OS10T0180800-01	5539707..5544577	993	WAK	稻瘟病菌
I	Os12g0478200	OS12T0478200-02	17384941..17389791	146	WAK	稻瘟病菌菌
I	Os02g0632800	OS02T0632800-01	25348200..25351764	537	WAK	防御响应
I	Os04g0370900	OsJ_14461	18042194..18049456	757	WAK	防御响应
I	Os04g0371200	OS04T0371200-00	18070893..18084166	433	WAKL	防御响应
I	Os02g0111600	OS02T0111600-01	627684..630558	737	WAK	非寄主抗性
I	Os02g0632100	OS02T0632100-00	25319245..25321441	522	WAKL	非寄主抗性
I	Os02g0632900	OS02T0632900-00	25356313..25360193	363	WAK	非寄主抗性
I	Os04g0376000	OS04T0376000-01	17723490..17725577	123	WAKL	非寄主抗性
I	Os04g0598600	OS04T0598600-00	30196064..30200249	483	WAKL	非寄主抗性
I	Os06g0142500	OS06T0142500-00	2215228..2233282	765	WAK	非寄主抗性
I	Os10g0174500	not found	5156960..5160958	569	WAKL	非寄主抗性
I	Os11g0564900	OS11T0564900-00	20672355..20676757	1014	WAKL	非寄主抗性
I	Os11g0693800	OS11T0693800-01	28216209..28224297	260	WAK	非寄主抗性
I	Os04g0307500	OS04T0307500-01	13863201..13868219	945	WAK	非寄主抗性，响应稻瘟病菌
I	Os03g0642600	OS03T0642600-00	24759067..24764908	697	WAK	细菌
II	Os06g0681200	OsJ_22381	28388374..28389610	279	eNod-like AGPs	防御响应；非寄主抗性，防御响应
II	Os02g0461000	OS02T0461000-01	15436649..15437657	213	FLAs	非寄主抗性
II	Os08g0532800	OsJ_28065	26554178..26557084	179	non-classical AGPs	非寄主抗性
II	Os03g0852400	OsJ_13402	35895654..35896833	219	non-classical AGPs	稻瘟病菌
II	Os06g0686400	OS06T0686400-02	28617452..28620311	125	non-classical AGPs	稻瘟病菌
II	Os07g0175600	P0534H07.2	3980195..3981229	170	non-classical AGPs	稻瘟病菌
II	Os07g0573900	OS07T0573900-00	23202706..23203292	86	classical AGPs	稻瘟病菌
II	Os08g0482300	AGP1	23847837..23848642	146	classical AGPs	稻瘟病菌
II	Os03g0192600	OS03T0192600-02	4820698..4822746	211	non-classical AGPs	防御响应
II	Os05g0489200	OS05T0489200-01	24045564..24047854	244	xylogen-like AGPs	防御响应
II	Os03g0804200	OsJ_13008	33563698..33566680	195	classical AGPs	非寄主抗性
III	Os12g0242100	OsJ_35694	7874184..7875266	255	GRP	防御响应
III	Os10g0450800	OS10T0450800-02	16426002..16430085	220	GRP	非寄主抗性
III	Os01g0720500	OsJ_03282	4231855..4234391	265	GRP	响应稻瘟病菌，非寄主抗性
III	Os04g0660400	RGP2	33377311..33378592	347	GRP	病原效应蛋白
III	Os01g0916100	OS01T0916100-01	39925611..39927334	171	GRP	稻瘟病菌
III	Os02g0587300	OsJ_07310	22636045..22637215	122	GRP	稻瘟病菌
III	Os02g0588000	not found	22655510..22656126	617	GRP	稻瘟病菌
III	Os10g0454200	OsJ_31755	16592265..16593105	189	GRP	稻瘟病菌
III	Os10g0452800	OsJ_31745	16515841..16516724	395	GRP	防御响应
III	Os04g0268700	OsJ_14074	11130452..11131502	369	GRP	防御响应；稻瘟病菌
III	Os03g0319300	OS03T0319300-01	11030538..11032835	149	GRP	防御响应；非寄主抗性
III	Os10g0450900	GRP0.9	16454006..16455077	185	GRP	防御响应；病原效应；非寄主抗性
IV	Os02g0725300	CSLE2	30148767..30153830	745	CSLE	非寄主抗性
IV	Os02g0192500	CSLA1	5151793..5158912	521	CSLA	稻瘟病菌
IV	Os03g0808100	CESA2	33780506..33786462	1073	CesA	稻瘟病菌
IV	Os03g0837100	OsJ_012702	35177575..35183302	1092	CeSA	稻瘟病菌
IV	Os04g0430600	OS04T0430600-01	21288132..21293893	337	CSLH	稻瘟病菌
IV	Os05g0176100	OsJ_016545	4565274..4571456	1076	CeSA	稻瘟病菌
IV	Os06g0625700	OsJ_22033	25231174..25235897	527	CSLA	稻瘟病菌
IV	Os10g0341700	CSLH1	10089455..10095036	750	CSLH	稻瘟病菌
IV	Os01g0750300	CESA4	31422936..31428656	989	CesA	非寄主抗性
IV	Os09g0478300	CSLE6	18315976..18322384	627	CSLE	非寄主抗性
V	Os04g0660900	OS04T0660900-01	33729795..33733349	631	NPF	防御响应
V	Os03g0138700	OS03T0138700-01	2131975..2136744	600	NPF	非寄主抗性
V	Os04g0597600	OS04T0597600-01	30156228..30159325	570	NPF	防御响应；稻瘟病菌
V	Os02g0699000	OS02T0699000-01	28749582..28753056	574	NPF	非寄主抗性

GCP作物：国际挑战计划（Generation Challenge Program）中列入的作物物种

3.2阿拉伯半乳糖蛋白与水稻病原菌响应

阿拉伯半乳糖蛋白是广泛分布于植物体内的一类富含羟脯氨酸糖蛋白的总称。根据其核心蛋白骨架和保守结构域可以分为7个亚类: 经典 AGPs、非经典AGPs、赖氨酸富集AGPs、AG多肽、类成束蛋白AGPs、类木质形成素AGPs和类植物蓝素AGPs[3]。本数据集中有69个为阿拉伯半乳糖蛋白，占细胞壁相关蛋白的20.12%（表1）。69个阿拉伯半乳糖蛋白除了在水稻11号染色体上未有分布，在其余染色体上均有分布。虽然在染色体上的分布较为分散，但其中27个蛋白之间存在互作，OSJ_28509等17个蛋白之间的互作较为紧密，具有共表达特性，并且假定的同源基因在其他物种中也具有共表达特性。OSJ-12880，OS03T0128000-01（图2）和OSJ_28509三个蛋白为关键节点，与多个蛋白存在互作。其中11个蛋白为水稻抗病性调控蛋白（表2）。

3.3富甘氨酸细胞壁结构蛋白与水稻病原菌响应

植物富甘氨酸细胞壁结构蛋白是一类在组成结构上由甘氨酸高度重复序列组成的蛋白质。在水稻中有60个富甘氨酸细胞壁结构蛋白（GRPs），占水稻细胞壁相关蛋白数量的17.49%（表1）。进一步对GRPs在水稻染色体上的位置进行分析后发现，GRPs除在水稻11号染色体上未有分布，在其余水稻染色体上均有分布，有12个蛋白为水稻抗病性调控蛋白，包括抗稻瘟病菌及非寄主抗性（图１，表2）。

3.4纤维素代谢酶与水稻病原菌响应

水稻纤维素的合成与代谢主要依赖于CesA（Cellulose synthase, Ces）及CSL（Cellulose synthase-like protein, CSL）两大家族蛋白完成。在拟南芥中对CSL家族蛋白进行细分，又可以将其分为CSLA/B/C/D/E/F/G/H等8个家族[10]。纤维素代谢酶蛋白有43个，占细胞壁相关蛋白数量的12.54%（表1）。纤维素代谢酶除了在水稻11号染色体上未有分布外，其余染色体上均有分布。STRING分析的结果表明，有40个蛋白之间存在各种方式的互作，互作方式具体表现为在水稻中具有共表达；假定的同源蛋白在其他物种中有描述以及假定的同源基因在其他物种中被证明具有互作，其中9个蛋白的互作已有试验证据。这就表明，本研究结果中蛋白质之间存在多种模式的互作，至少40个蛋白之间存在共表达特性。有10个蛋白参与了对病原菌的响应，包括抗稻瘟病菌与非寄主抗性（表2）。

3.5 NPF家族蛋白基本信息与水稻病原菌响应

NPF家族蛋白是协助植物吸收硝酸根及多肽的一类转运蛋白。通过对水稻细胞壁相关蛋白进行统计分类，得到了33个NPF家族蛋白，占水稻细胞壁相关蛋白数量的9.62%（表1）。NPF家族蛋白除了在水稻8，9号染色体上未有分布，在水稻其他染色体上均有分布。 除了6个蛋白外，其它蛋白之间存在非常紧密的互作。互作的主要方式为在同一基因组共同出现和在管理数据库中具有关联。在对NPF家族蛋白对水稻病原菌的响应进行分析时，发现有4个编码蛋白的基因对病原菌侵染有响应，主要表现为水稻的基础抗性（表2）。

4水稻细胞壁相关蛋白类别内及类别间互作网络分析

4.1水稻细胞壁相关蛋白类别内的互作网络分析

通过利用NCBI对水稻细胞壁相关蛋白编码基因信息进行查询，我们得到了这些基因在水稻染色体上的分布。分析发现，这些编码水稻细胞壁相关蛋白的基因均分散在水稻染色体上，除水稻11号染色体上分布的细胞壁相关蛋白种类较少以外，其他染色体上均有不同种类的细胞壁相关蛋白分布（图1）。利用STRING平台，我们对上述5类蛋白的类别内的互作网络关系进行了分析。结果表明细胞壁相关受体激酶与富甘氨酸细胞壁结构蛋白类别内蛋白间不存在互作，而阿拉伯半乳糖蛋白及纤维素代谢酶类别内蛋白间具有较为密切的互作，尤其是NPF家族蛋白内蛋白间的互作最为紧密，几乎所有NPF家族蛋白彼此间都具有互作。这表明细胞壁相关受体激酶和富甘氨酸细胞壁结构蛋白的互作蛋白分布在其它的细胞组分中。纤维素代谢酶及阿拉伯半乳糖蛋白类别内蛋白之间存在多种模式的互作。进一步分析发现，阿拉伯半乳糖蛋白类别内互作最为密切的是类成束蛋白（fasciclin）。而纤维素代谢酶类中具有较多相互作用的蛋白主要为含有跨膜螺旋结构域的蛋白。在对水稻纤维素代谢酶及阿拉伯半乳糖蛋白进行功能富集后，发现这2类蛋白都参与了纤维素合成、代谢过程及有丝分裂后的细胞分裂。并且能够影响纤维素合酶、甘露聚糖合酶以及糖基转移酶的活性。NPF家族蛋白类别内关联最为密切。按照软件默认值对33个NPF家族蛋白类别内蛋白进行关联后得到仅有6个蛋白不存在类别内的互作。这意味着NPF家族蛋白内各蛋白之间关联密切，能够强力互作，共同完成水稻对硝酸盐离子及多肽等营养物质的转运、吸收及其它生物学功能。在对NPF参与的信号路径进行分析时，发现其参与中性粒细胞脱颗粒、寡肽转运以及SLC（solute-linked carrier）基因家族调节的跨膜运输过程。

图1.水稻细胞壁相关蛋白编码基因在各染色体上的数量分布

Fig 1. Number of gene encodingAnalysis of rice cell wall related proteins and their interaction networks cell wall related protein on chromosome

A B C （注：各类蛋白的缩写同表1）

图2 阿拉伯半乳糖蛋白（A）、NPF家族蛋白(B)和纤维素代谢酶(C)类别内蛋白互作网络

Fig 2. Network within group of AGPs, NPFs and CMEs

4.2 水稻细胞壁相关蛋白类别间的互作网络分析

经过分析水稻细胞壁相关蛋白类别内互作的程度，我们明白不同蛋白类别内互作的方式存在显著差别。那么，不同种类的蛋白之间是否也存在互作关系呢？我们利用STRING对5类蛋白的类别间互作关系进行了两两互作分析（图3）。分析后发现发现细胞壁相关受体激酶、富甘氨酸细胞壁结构蛋白类别间不存在互作。而阿拉伯半乳糖蛋白及纤维素代谢酶类别间具有密切的互作。通过分析纤维素代谢酶和阿拉伯半乳糖蛋白类别间蛋白的互作，发现21个蛋白具有较为密切的互作（11个为纤维素合成酶，10个为阿拉伯半乳糖蛋白）。这些蛋白互作的具体方式包括共表达（co-expression），其同源蛋白在文献中共描述（textmining），以及利用实验验证过的这些蛋白的同源蛋白在其他物种中具有互作关系。由于两类别间的互作方式主要是共表达和共描述，表明两类蛋白的合成在时间上有同步性，而且在文献中有共描述特性。具有GPI锚定信号的蛋白锚定在细胞膜表面，能够对细胞膜进行稳定有效地修饰，并且在信号转导方面也具有重要功能[11]。而纤维素合成酶的表达受到诸多因素的影响，在不同的生长发育期及环境条件下都会有所不同[12]。根据以上两点及得到的二者蛋白互作网络图（图3）。有趣的是，两类蛋白间有互作的蛋白都是类别内存在互作关系的蛋白。表明纤维素合成这一过程是这两类蛋白之间相互调节而协同完成的。

纤维素代谢酶 阿拉伯半乳糖蛋白

图3纤维素代谢酶和阿拉伯半乳糖蛋白类别间蛋白相互作用

Fig 3. Network among proteins of AGPs and CMEs group

5讨论

通过新版本的基因组检索，得到了水稻细胞壁相关的343个蛋白。新检索得到的138个水稻细胞壁相关受体激酶，与之前得到的125个相比有所增加[13]。这也说明随着研究的不断深入，数据库也在不断更新中，有更多的细胞壁相关受体激酶得到鉴定。在结构上，细胞壁相关受体激酶的双内含子基因结构在水稻中依然普遍保守；然而，胞外结构域同源性较低，只有40%~64%[14]。阿拉伯半乳糖蛋白新检索得到的数量与之前的研究一致[15,16]。这可能也反映了近期阿拉伯半乳糖蛋白的研究较少。迄今为至，已从玉米 ( Zea mays )、水 稻 ( Oryza sativa )、拟 南 芥( Arabidopsis thaliana )、烟草( Nicotiana tabaccum )等不同植物中分离和鉴定出了150多种富甘氨酸细胞壁结构蛋白，但与之前相比富甘氨酸细胞壁结构蛋白的功能已经不仅限于对细胞壁中其他组分的分布起到支架作用。有研究表明富甘氨酸细胞壁结构蛋白可以作为某些蛋白激酶的胞外配体，参与植物-病原体的互作[3,17]。纤维素代谢酶可分为CesA和CSL2类，目前在水稻中鉴定得到40多个CesA和CSL基因[18,19]。这与我们检索后获得的结果也是一致的。本研究检索到33个与水稻细胞壁相关的NPF家族蛋白，是NPF家族蛋白总量的三分之一[20]。最近的研究还表明NPF家族蛋白的转运范围已不局限于硝酸盐和多肽，在植物对多种激素转运过程中NPF家族蛋白也具有重要作用。另外，NPF家族蛋白还被发现参与了植物抗病机制[21]。

细胞壁相关蛋白种类繁多，但一些蛋白质嵌合在细胞壁中，或是部分嵌合在细胞壁的纤维素、木质素等成分中，为这些蛋白的纯化、功能和结构，及其互作研究带来了许多困难。染色体上的分布并不能为这些蛋白的分布提供更多信息，所以利用生物信息学手段进行分析和数据挖掘就显得更为重要。本研究对上述各类蛋白进行类别内和类别间的蛋白互作分析时，发现不同类型蛋白之间互作模式存在显著差别。细胞壁相关受体激酶与富甘氨酸细胞壁结构蛋白类别内蛋白间未找到相互作用的蛋白质；阿拉伯半乳糖蛋白和纤维素代谢酶类别内蛋白间存在较多的互作；NPF家族蛋白内蛋白的互作最为紧密。这表明，与这几类蛋白互作的蛋白是分布在细胞的其它部位，其互作关联与细胞壁方向是垂直的。但阿拉伯半乳糖蛋白和纤维素代谢酶两类细胞壁相关蛋白之间也存在互作。表明这两类蛋白可能在细胞壁上就能直接或间接互作，对研究这两类蛋白，尤其是两类蛋白中直接互作的蛋白分布和功能研究，都具有重要的参考意义。

植物细胞壁是病原体在植物组织中成功定植所必须克服的障碍之一。细胞壁生物合成或重构所需要的相关蛋白损伤会改变细胞壁的完整性从而影响植物对病原菌的抗性。以前对受体类蛋白对抗病性的贡献分析较多，而对其它几类蛋白涉及的还很少。利用多种分析平台对基因组数据进行综合分析，可以更好地挖掘功能基因，了解蛋白质之间的互作及参与调控的发育或逆境响应。本文分析利用水稻基因组数据注释平台、蛋白互作平台和水稻与病原菌互作数据平台分析了与细胞壁相关的一些蛋白质的互作，并与水稻与病毒、细菌、真菌等不同类别病原菌的互作相关基因进行综合分析。结果表明，本文所述及的细胞壁各类蛋白编码基因在染色体上基本不存在成簇分布的情况，但一些蛋白可通过蛋白互作产生类别内或类别间的相互作用，而且各类别蛋白中都能够检索到病原菌互作相关的调节蛋白。这些蛋白既是水稻对不同种类病原抗性的重要标记分子，也是功能研究的重要候选蛋白。本研究结果更进一步明确了细胞壁这一重要结构在寄主与病原菌互作中的基础作用，其中一些还是与非寄主抗性相关的功能蛋白，值得今后利用各种新的研究方法系统、深入地探索这些蛋白对抗病性的贡献，并在抗病育种中更好地利用这些非寄主抗性蛋白。

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基金项目：国家重点研发计划资助 (No. 2017YFD0200400)。

作者简介：叶倩男（1995.1），女，植物寄主与病原互作机制

通信联系人：李成云，男，博导，分子植物病理学. E-mail: licheng_yun@163.com