高产精氨酸脱亚胺酶菌株的复合诱变选育及其发酵工艺优化（已修改） #

孙潇文，张涛，江波**

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122）

2.02.02.02.02.02.02.0State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122；State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122；State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122214122;214122;21412217851306619;13915323543;17851306619;13915323543;江苏省无锡市滨湖区江南大学;江苏省无锡市滨滨湖区江南大学;江苏省无锡市滨湖区江南大学gracexws@163.com;zhangtao@jiangnan.edu.cn;bjiang@ jiangnan.edu.cn孙潇文(1994-)女,硕士,主要研究方向:食品生物技术;张涛(1973-),女,教授,博导,主要研究方向:食品功能配料的研究与开发;江波（1962-），男，教授，博导，研究方向：酶在食品生物制造中的应用孙潇文;张涛;江波SUN Xiaowen;ZHANG Tao;JIANG Bo张涛十三五重点研发计划（2017YFD0400600）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0

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高产精氨酸脱亚胺酶菌株的复合诱变选育及其发酵工艺优化（已修改）|Breeding of High Arginine Deiminase Producing Strain by Compound Mutagenesis and Its Fermentation Process Optimization(已修改)|十三五重点研发计划（2017YFD0400600）|1|孙潇文|SUN Xiaowen|江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122|State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122|孙潇文(1994-)女,硕士,主要研究方向:食品生物技术|江苏省无锡市滨湖区江南大学|214122|gracexws@163.com|17851306619|17851306619<CR>*|2|张涛|ZHANG Tao|江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122|State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122|张涛(1973-),女,教授,博导,主要研究方向:食品功能配料的研究与开发|江苏省无锡市滨滨湖区江南大学|214122|zhangtao@jiangnan.edu.cn|13915323543|13915323543<CR>|3|江波|JIANG Bo|江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122|State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122|江波（1962-），男，教授，博导，研究方向：酶在食品生物制造中的应用|江苏省无锡市滨湖区江南大学|214122|bjiang@ jiangnan.edu.cn||

摘要： 以粪肠球菌SK 32.001为出发菌株，经过化学诱变和常温室压等离子体诱变，平板初筛和摇瓶复筛，获得了高产精氨酸脱亚胺酶菌株A3。经过发酵调控工艺条件优化进一步提高了该菌株的产酶能力。结果表明，在3 L发酵罐水平下，以蔗糖为碳源，牛肉膏为氮源，溶氧值控制在20%，诱变菌株A3的酶活为3.12 U/mL，比原始菌株提高了162.18%。

关键词：粪肠球菌；精氨酸脱亚胺酶；化学诱变；ARTP诱变

中图分类号：TS201

Breeding of High Arginine Deiminase Producing Strain by Compound Mutagenesis and Its Fermentation Process Optimization(已修改)

SUN Xiaowen, ZHANG Tao, JIANG Bo

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122)

Abstract: To improve the arginine deiminase producing ability, Enterococcus faecalis SK 32.001 was mutated using chemical method coupled with atmospheric room temperature plasmas. A high arginine deiminase producing strain A3 was obtained by plate initial screening and re-screening in shake flask fermentation. Then the enzyme producing ability of the strains was further improved by optimizing fermentation conditions. The results showed that the enzyme activity of the mutant strain A3 was 3.12 U/mL with sucrose and beef extract as carbon and nitrogen sources, respectively, and with the dissolved oxygen value was controlled at 20%. Compared with the original strain, the enzyme activity was improved by 162.18%.

Key words: Enterococcus faecalis; arginine deiminase; chemical mutagenesis; atmospheric room temperature plasmas

引言

瓜氨酸是一种α-氨基酸，于1914年右贺太郎从西瓜汁液中分离得出，具有清除自由基、舒张血管、诊断类风湿性关节炎等功能，在医药领域广泛应用[1-3]。瓜氨酸的生产方法有酶转化法、发酵法、提取法和化学合成法。其中提取法和发酵法操作流程复杂，成本高，难以在工业生产中广泛应用。化学合成法在纯化过程中要使用毒性气体硫化氢，不利于环境保护[4-5]。而利用精氨酸脱亚胺酶生产瓜氨酸，可以避免瓜氨酸全合成途径中的反馈调节，使瓜氨酸积累到较高浓度[6]。

精氨酸脱亚胺酶（Arginine deiminase，ADI）是一种精氨酸降解酶，能够将精氨酸分解成瓜氨酸，氨气和CO2。精氨酸脱亚胺酶存在于很多微生物有机体中，在粪链球菌(Enterococcus faecalis)、盐沼盐杆菌（Halobacterium salinarium）、乳链球菌(Lactococcus lactis)、假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)等[7-9]微生物细胞中均有精氨酸脱亚胺酶的存在，但在高等真核细胞中目前还没有发现精氨酸脱亚胺酶。孟繁君[10]运用Pseudomonas sp.来源的ADI生产瓜氨酸，通过优化培养基，发酵罐扩大培养，酶活上升至2.17 U/mL。李加友等[11]筛选出一株高产ADI菌株，经鉴定其为E. faecalis，经过发酵罐优化，其酶活为2.57 U/mL。近年来科研人员研究发现野生型酶存在酶活力低，底物亲和力弱，稳定性差等问题。因此，通过基因克隆技术来改善ADI的酶学性质尤为重要。Kim等[12]将Mycoplasma hominis的精氨酸脱亚胺酶基因克隆到pET47，并在E. coli BL21（DE3）中表达，比酶活为0.16 U/mg。刘咏梅等[13]将P. plecoglossicida的精氨酸脱亚胺酶基因在E.coli中克隆表达，酶活为2.04 U/mL。工程菌在异源表达过程中多以包涵体形式存在，其发挥作用需要经过变性，复性等复杂过程，不利于大规模工业化生产[14]。这也是ADI克隆表达的研究瓶颈。而通过诱变技术可以避免包涵体的产生，通过一定的物理、化学方式对菌株进行诱变，可以从基因层面上改变菌株性质，筛选获得综合性能较高的菌株。

本研究以实验室筛选获得的E. faecalis SK 32.001为出发菌株，使用化学诱变和常温室压等离子体诱变技术（ARTP），经过平板初筛，摇瓶发酵复筛，筛选出产酶能力高，遗传稳定的菌株。再通过发酵罐优化，来进一步提高精氨酸脱亚胺酶酶活力。

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E. faecalis SK 32.001，由本实验室筛选获得。

1.1.2 培养基

基础培养基：5 g/L鱼粉蛋白胨，10 g/L葡萄糖，0.1 g/L NaCl，1 g/L磷酸氢二钾，15 g/L琼脂，PH 6.0；种子培养基：5 g/L精氨酸，5 g/L鱼粉蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L葡萄糖，0.1 g/L NaCl，1 g/L磷酸氢二钾，1.5 g/L氯化铵，PH 6.0；发酵培养基：10 g/L精氨酸，5 g/L鱼粉蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L葡萄糖，0.1g/L NaCl，1 g/L磷酸氢二钾，PH 6.0。

1.1.3 试剂

酵母提取物，鱼粉蛋白胨，瓜氨酸，精氨酸等，生工生物工程（上海）有限公司；硫酸二乙酯，三水合乙酸钠，三乙胺，四氢呋喃，冰醋酸，甲醇，乙腈等，中国医药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 仪器与设备

SW-CJ-1FD超净工作台，苏净集团安泰空气技术有限公司；恒温培养摇床THZ-100，上海一恒科技有限公司；GI54DWS型立式压力蒸汽灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；Centrifuge5804R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；ARTP-M 型诱变育种系统，无锡思清源生物科技有限公司； SHA-2冷冻恒温水浴振荡器，江苏太仓实验设备厂；四联3 L发酵罐，美国New Brunswick Scientific Edison公司；高效液相色谱仪Agilent 1260，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 E. faecalis SK 32.001生长曲线的测定

将甘油管保存的E. faecalis SK 32.001稀释涂布到基础培养基上，37 ºC条件下静置培养12 h；将平板上单个菌落接入50 mL种子培养基中，于37 ºC、200 r/min条件下振荡培养，每隔2 h取样，在波长600 nm处测定吸光值，绘制菌株的生长曲线，确定E. faecalis SK 32.001的指数生长期。

1.2.2 菌悬液的制备

取8 mL对数生长期的菌液至10 mL离心管中，3000 r/min离心5 min，弃上清，用50 mmol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液洗涤2次。用8 mL磷酸缓冲液（150 mmol/L、pH 6.5）悬浮，即得菌悬液。

1.2.3 化学诱变

在稀释的菌悬液中加入终浓度为0.5 %的硫酸二乙酯溶液，37 ºC、200 r/min条件下分别处理10、20、30、40、50和60 min，分别取100 μL菌液，添加25 %的硫代硫酸钠溶液100 μL终止反应，稀释涂布到基础培养基中。置于37 ºC培养12 h。观察活菌数，计算致死率，确定化学诱变处理的最适时间。

1.2.4 初筛与复筛

确定最佳诱变时间，进行诱变育种。将诱变处理后的菌悬液稀释涂布到基础培养基中，待菌落生长成熟后，从平板中挑取长势良好、菌落大的单菌落作为初选菌，接入种子培养基中，37 ºC、200 r/min培养14 h，之后以2 %的接种量接种到装液量为50 mL/250 mL锥形瓶中摇瓶培养复筛，培养条件为：37 ºC、200 r/min发酵培养20 h，获得菌体至于-20 ºC保存。

1.2.5 ARTP诱变

将经过化学诱变处理筛选获得的菌株作为出发菌株，按上述方法制得菌悬液，在无菌环境下将10 μL菌悬液均匀涂布于已灼烧灭菌的载片上，并将载片置于充满高纯氦气的ARTP中处理，处理距离2 mm，气流量10 SLM，处理功率120 W，处理时间分别为0、5、10、15、20、40、60、80和100 s。样品处理完毕后，将载片放于990 μL磷酸盐缓冲液（pH 6.5、50 mmol/L）中振荡2-3 min以洗脱菌体，适量稀释后涂布到平板培养基中。记录平板菌落数，并计算致死率。选取致死率在90 %左右时作为诱变处理时间。筛选流程同化学诱变。

1.2.6 遗传稳定性实验

将筛选得到的突变菌株进行稳定性考察，连续传6代。将甘油管保存的突变菌株编号为原液，用磷酸盐缓冲液（pH 6.5、50 mmol/L）将原液依次稀释10、102倍，并分别对其进行编号。之后分别吸取原液和稀释的原液各100 µL涂布于基础培养基中，于37 ºC培养12 h。之后按上述方法将菌株连续传代培养6代，将各代的菌株进行摇瓶发酵，用高效液相色谱测定各代菌株中精氨酸脱亚胺酶的酶活，以确定突变菌株的遗传稳定性。

1.2.7 粗酶液的制备与酶活测定

将-20 ºC保存的菌体用pH 6.5、50 mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤三次，再制备菌悬液，使用超声破碎仪进行20 min细胞破碎（功率为22 W、频率为间歇2 s、破碎1 s）。用4 ºC、转速10 000 r/min的冷冻离心机离心10 min后得到上清液即是所需的粗酶液。之后以100 g/L精氨酸溶液为底物，加入适量酶液，用50 mmol/L、pH 6.5磷酸盐缓冲液补充至1 mL反应体系混匀，在45 ºC条件下反应10 min，沸水浴10 min终止反应，离心取上清液。参考文献方法[15]测定瓜氨酸含量。

酶活定义：1 min催化精氨酸产生1 µmol L-瓜氨酸所需的酶活数量（1 U）。

1.2.8 发酵罐培养

将筛选获得的诱变菌株稀释涂布到基础培养基上，37 ºC条件下静置培养12 h，待菌落生长成熟后，将单个菌落接入50 mL种子培养基中，于37 ºC、200 r/min条件下培养至对数生长期，以2 %的接种量接种到3 L发酵罐中。发酵时以饱和Na2SO3溶液来校准溶氧电极的零点，发酵罐温度为37 ºC、装液量1.5 L、通气量为200 sL/h、转速400 r/min、未接种时培养基中的DO值为100%。

1.2.9 发酵罐工艺条件优化

采用单因素轮换法，分别对碳源种类（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖），氮源种类（鱼粉蛋白胨、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵），以及溶氧值（10%、20%、30%）进行发酵优化，定时取样测定菌株酶活。

1.2.10 数据处理

每次实验设置3个平行组，结果取平均值。用软件Origin Pro 8.5绘制图形。

结果

2.1 E. faecalis SK 32.001指数生长期的确定

以吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，如图1所示，菌株E. faecalis SK 32.001在前8 h，OD600值缓慢增长，此时菌株处于延缓期，在8～16 h，OD600值急速上升，菌株生长处于对数期，在16 h后菌株生长进入稳定期。微生物所处的生理状态对诱变效果有很大影响，对数期是基因复制和重组的重要阶段，在此阶段对菌株进行诱变处理，可以提高诱变菌株的遗传稳定机率[16]。因此选择在对数生长中期14 h时对菌体进行诱变处理。

图1 菌株E. faecalis SK 32.001的生长曲线

Fig.1 Growth curve of E.faecalis SK 32.0011

2.2 化学诱变

2.2.1 诱变时间的确立

在诱变过程中诱变处理时间直接影响实验的成败，不仅影响细胞存活率，还会造成细胞修复能力的不可逆损伤[17]。如图2所示，硫酸二乙酯（DES）对菌株的致死率存在明显的剂量关系，在0-30 min内，诱变处理时间越长，致死率越高。当菌悬液经化学诱变处理40 min时，致死率就达到了94.27%。处理60 min时，致死率接近100%。综合考虑存活率和诱变效果，本实验选择40 min作为诱变处理时间。

图2 硫酸二乙酯诱变处理时间与致死率的关系曲线

Fig.2 Relation curve between DES treatment time and lethality

2.2.2 初筛与复筛

将诱变处理的菌悬液稀释涂布于基础培养基中，置于37 ºC培养12 h。从平板中挑取长势良好、菌落大的单菌落，编号D1～D40，对初筛获得的40株菌株进行摇瓶发酵培养，测定菌株酶活。结果如图3所示，菌株的正突变率远远高于负突变率，其中突变菌株D8，D11，D17，D22，D35的酶活远高于原始菌株，因此选取这5株菌株进行甘油管保藏并进行遗传稳定性研究。

图3 化学诱变菌株与原始菌株酶活力的比较

Fig.3 Comparison of enzyme activity between chemical mutagenic strain and the original strain

2.2.3 遗传稳定性研究

传代结果如表1所示，突变菌株D11，D17，D35均具有良好的遗传稳定性，相较而言，菌株D11的稳定性更好，波动小，且酶活最高，在传代6次酶活为2.12 U/mL。因此选取突变菌株D11作为后续试验菌株。

表1 化学诱变菌株的遗传稳定性

Table.1 Genetic stability of chemical mutagenic strain

菌株	酶活(U/mL)
第1代 第2代 第3代 第4代 第5代 第6代
D11	2.02±0.05	2.28±0.00	1.92±0.04	2.08±0.04	2.06±0.04	2.12±0.05
D08	2.07±0.06	2.22±0.05	1.94±0.04	1.56±0.03	1.62±0.17	1.38±0.20
D17	1.89±0.06	1.92±0.00	1.76±0.04	1.84±0.00	1.90±0.08	1.92±0.03
D22	1.93±0.06	1.48±0.04	1.16±0.04	1.18±0.07	1.16±0.03	1.16±0.00
D35	1.82±0.02	1.62±0.03	1.74±0.05	1.54±0.03	1.64±0.00	1.60±0.03

2.3 ARTP诱变

2.3.1 诱变时间的确立

对突变菌株D11进行ARTP诱变操作，绘制ARTP致死曲线，据报道，等离子体中的活性粒子能够使微生物细胞结构及通透性改变，并造成微生物基因序列及其代谢网络发生变化，从而导致微生物发生突变[17]。如图4所示，菌株在5 s时致死率将近60 %，可能因为开始菌株对ARTP 较为敏感所致。在处理50 s时，致死率为97.18 %，超过50 s后致死率接近100 %，说明此时的辐射量是菌株的耐受极限，而致死率在90%以上更容易产生正突变[18]。因此选择50 s作为ARTP诱变的处理时间。

图4 ARTP诱变处理时间与致死率的关系曲线

Fig.4 Relation curve between ARTP treatment time and lethality

2.3.2 初筛与复筛

挑取培养基中40株菌株，编号为A1～A40，分别在37 ºC，200 r/min条件下摇瓶发酵培养20 h，测定酶活。结果如图5所示，菌株的正突变率小于负突变率，突变菌株A2，A3，A15，A24的酶活高于突变菌株D11，因此选取这4株菌株进行甘油管保藏并进行遗传稳定性研究。

图5 ARTP诱变菌株与化学诱变菌株D11酶活力的比较

Fig.5 Comparison of enzyme activity between ARTP mutagenic strain and chemical mutagenic strain D11

2.3.3 遗传稳定性研究

如表2所示，突变菌株A2出现明显的衰退趋势，突变菌株A24在传代培养中酶活不稳定，而突变菌株A3，A15酶活虽然略有起伏，但整体表现平稳。其中突变菌株A3产精氨酸脱亚胺酶的活性较为稳定而高效，传代6次的酶活为2.28 U/mL。因此，菌株A3可作为后续实验的研究和工业运用。

表2 ARTP诱变菌株的遗传稳定性

Table.2 Genetic stability of ARTP mutagenic strain

菌株	酶活(U/mL)
第1代 第2代 第3代 第4代 第5代 第6代
A2	2.15±0.05	1.58±0.05	0.96±0.04	0.84±0.08	0.58±0.00	0.54±0.06
A3	2.29±0.03	2.21±0.06	2.32±0.07	2.34±0.00	2.26±0.08	2.28±0.05
A15	2.10±0.15	2.05±0.03	2.09±0.03	2.0±0.09	2.10±0.07	2.01±0.01
A24	2.48±0.15	2.25±0.08	2.11±0.02	1.62±0.06	1.85±0.15	2.16±0.04

2.4 发酵罐工艺条件优化

2.4.1 碳源对菌株产酶能力的影响

碳是生物体的主要组成元素，是微生物生长发酵过程中重要的营养物质，它不仅为菌体提供生命活动所需要的能量，还被用于各类代谢产物的合成。如图6（A）所示，在0-16 h时，酶活随着发酵时间的延长而快速提高，乳糖作为发酵碳源时，酶活力最低，在发酵至16 h时菌株酶活为0.91 U/mL。蔗糖作为发酵碳源时，诱变菌株A3的酶活力远高于其他碳源，酶活为2.63 U/mL。因此选择蔗糖作为发酵培养基的碳源。

2.4.2 氮源对菌株产酶能力的影响

氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物，分为有机氮源和无机氮源两类，不同氮源对菌株产酶能力以及发酵环境有一定的影响。如图6（B）所示，在发酵时间至16 h时，以牛肉膏作为培养基氮源的酶活为2.83 U/mL, 以鱼粉蛋白胨作为培养基氮源的酶活为2.21 U/mL，以无机氮源氯化铵作为培养基成分时，菌体生长缓慢，菌株酶活力较低，在发酵至16 h时，酶活仅为0.76 U/mL。而硫酸铵作为氮源时也不利于生物量的积累。所以选择牛肉膏作为诱变菌株A3发酵培养基的氮源。

2.4.3 溶氧值控制对菌株产酶能力的影响

在发酵中期，菌体会呈指数型增长，需氧量大于供氧量，供氧不足会造成菌体生长速率下降，甚至发生自溶。因此通过控制溶氧值可以优化菌株的产酶能力。本实验以未控制溶氧时菌株的酶活力变化作为对照，实验结果如图6（C）所示，当溶氧值控制在20%时，菌株的酶活力最高，为3.12 U/mL，而将溶氧值控制在30%，酶活力下降，为2.74 U/mL。这表明菌株产酶是一个耗氧的过程，但并不是溶氧量越大酶活力越高。因此将溶氧值控制为20%时，最有利于诱变菌株A3的生长和酶活力的提高。

A：碳源对发酵产酶的影响；B：氮源对发酵产酶的影响；C：溶氧值对发酵产酶的影响

图6 不同发酵工艺条件对发酵产酶的影响

A：Effect of carbon source on enzyme production；B：Effect of nitrogen source on enzyme production；C：Effect of dissolved oxygen value on enzyme production

Fig.6 Effects of different fermentation process conditions on enzyme production

讨论

瓜氨酸作为一种非蛋白质氨基酸，具有重要的生理功能，在市场上具有广阔的应用前景，而目前利用酶法合成存在酶活力低，成本高等问题，因此筛选高产精氨酸脱亚胺酶菌株并提高其产酶能力具有重要研究意义。而诱变育种已成为改良菌株的重要手段，其方法操作简单，周期短，广泛用于工业微生物和农业植物中。常用的诱变方法分为物理诱变和化学诱变[19]。化学诱变中使用的硫酸二乙酯是一种较强的诱变剂,致死率很高,可以提高菌株的正突变率。常温室压等离子体诱变属于物理诱变，其具有处理温度低、常压下就可产生高活性等离子体射流等优点[20-21]。

本研究发现在以化学诱变筛选获得的菌株D11作为出发菌株，进行ARTP诱变时，诱变后获得的A3与菌株D11相比，酶活提高了7.5%，这说明复合诱变能克服单一诱变的饱和现象[22]，本实验复筛获得的菌株只有少部分产酶能力提高，其原因可能是不同的诱变方法对生物体的作用特点和诱变率是有差异的。因此在选择复合诱变方法时，要加强不同诱变方法的作用机理及诱变规律的研究[23]。

目前通过诱变技术生产精氨酸脱亚胺酶在实际应用中还存在许多问题，诱变育种具有随机性，因此大量的筛选工作是获取目的菌株的关键，而摇瓶发酵工作量大，周期长，故今后应加强在优良菌种筛选标准方面的研究，从而提高筛菌效率。

结论

本文使用硫酸二乙酯对实验室前期筛选获得的粪肠球菌SK 32.001进行诱变，根据致死率确定最佳化学诱变时间为40 min，通过平板初筛，摇瓶发酵复筛获得菌株D11，传代培养后通过液相色谱测定出酶活为2.12 U/mL，将筛选获得的菌株D11进行ARTP复合诱变，根据致死率确定最佳诱变时间为50 s，通过筛选获得高产精氨酸脱亚胺酶菌株A3，经传代培养6次，菌株酶活为2.28 U/mL。为进一步提高产酶量，对诱变菌株A3进行发酵罐工艺条件优化，在最优发酵条件下，菌株酶活为3.12 U/mL，与原始菌株相比提高了162.18%。

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基金项目：十三五重点研发计划（2017YFD0400600）

作者简介：孙潇文(1994-)女,硕士,主要研究方向:食品生物技术

通信联系人：张涛(1973-),女,教授,博导,主要研究方向:食品功能配料的研究与开发. E-mail: zhangtao@jiangnan.edu.cn