沉默PBX1抑制慢性髓细胞白血病细胞生长的转录组研究 #

万严，黄晓瑞，赵昀**

（苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123；Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123；Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123;苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123;苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123215123;215123;21512313295153907;18051297494;15950075460051265880899;051265880899;051265880899苏州工业园区仁爱路199号，苏州大学唐仲英血液学研究中心;苏州工业园区仁爱路199号，苏州大学唐仲英血液学研究中心;苏州工业园区仁爱路199号，苏州大学唐仲英血液学研究中心wanyanbio@163.com;1660178825@qq.com;zhaoy@suda.edu.cn万严（1993-），女，硕士研究生，白血病细胞与分子致病机制研究;黄晓瑞（1992-），女，白血病细胞与分子致病机制;赵昀（1973-），男，教授、博导，白血病细胞与分子致病机制万严;黄晓瑞;赵昀WAN Yan;HUANG Xiaorui;ZHAO Yun赵昀国家自然科学基金面上项目（31771579）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*Sherbenou DW, Druker BJ. Applying the discovery of the Philadelphia chromosome[J]. 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PLoS One, 2014, 9(1):e86195.沉默PBX1抑制慢性髓细胞白血病细胞生长的转录组研究|Transcriptome analysis of PBX1 silenced chronic myeloid leukemia CD34+ cells|国家自然科学基金面上项目（31771579）|1|万严|WAN Yan|苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123|Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123|万严（1993-），女，硕士研究生，白血病细胞与分子致病机制研究|苏州工业园区仁爱路199号，苏州大学唐仲英血液学研究中心|215123|wanyanbio@163.com|051265880899|13295153907<CR>|2|黄晓瑞|HUANG Xiaorui|苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123|Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123|黄晓瑞（1992-），女，白血病细胞与分子致病机制|苏州工业园区仁爱路199号，苏州大学唐仲英血液学研究中心|215123|1660178825@qq.com|051265880899|18051297494<CR>*|3|赵昀|ZHAO Yun|苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州市 215123|Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123|赵昀（1973-），男，教授、博导，白血病细胞与分子致病机制|苏州工业园区仁爱路199号，苏州大学唐仲英血液学研究中心|215123|zhaoy@suda.edu.cn|051265880899|15950075460

摘要：目的：初步探讨PBX1沉默抑制慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）细胞生长的分子机制。方法：检测对照和PBX1沉默K562细胞的本底凋亡，并检测经伊马替尼处理后细胞凋亡的状况；检测对照和PBX1沉默的正常骨髓CD34+细胞的集落生成能力；建立对照和PBX1沉默的CML患者CD34+细胞的RNA-seq数据，并在多个细胞模型中进行表达验证。结果：PBX1沉默可增强K562细胞的本底凋亡，并使这些细胞更易响应伊马替尼诱发的细胞凋亡；PBX1沉默抑制正常骨髓CD34+细胞的集落生成能力；RNA-seq数据及表达验证显示UCHL3、FUT8、MAPKAP1和KDM1B等基因的表达受到PBX1沉默的抑制，且这些基因在CML患者CD34+细胞中表达较正常对照细胞显著增高，提示它们可能在CML细胞生长中发挥重要作用。结论:PBX1沉默可使K562细胞更易响应伊马替尼诱发的细胞凋亡，PBX1是重要的人类造血调控因子，沉默PBX1可降低多个CML干/祖细胞中异常高表达基因的表达。本研究为理解PBX1沉默抑制CML细胞生长提供了重要线索。

关键词：慢性髓细胞白血病；PBX1；CD34+细胞；

中图分类号：R73

Transcriptome analysis of PBX1 silenced chronic myeloid leukemia CD34+ cells

WAN Yan, HUANG Xiaorui, ZHAO Yun

(Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, Suzhou 215123)

Abstract:Objective: The present study aims to understand the molecular mechanism of how PBX1 silencing inhibits the growth of chronic myeloid leukemia (CML) cells. Methods: The control and PBX1 silenced K562 cells were subjected to apoptosis analysis with 7-AAD/Annexin V staining, with and without imatinib mesylate (IM) treatment. The colony-forming cell (CFC) production of control and PBX1 silenced human normal bone marrow CD34+ cells was measured. RNA-seq data of control and PBX1 silenced CML CD34+ cells were obtained, and gene expression validation with various cellular models was performed. Results: Silence of PBX1 increased apoptotic index of K562 cells without IM treatment, and PBX silencing promoted apoptosis of K562 cells induced by IM treatment. PBX1 silencing inhibited the CFC production of normal CD34+ cells, suggesting an improtant role of PBX1 in regulating human normal hematopoesis. The expression of several transcripts, including UCHL3, FUT8, MAPKAP1 and KDM1B were significantly inhibited upon PBX1 silencing, and these transcripts had higher expression in CML CD34+ cells than normal control cells, suggesting possible roles of these candidate genes in CML pathology. Conclusion: PBX1 silencing increased the apoptotic index of K562 cells, and rendered these cells enhanced response to IM induced apoptosis. PBX1 silencing inhibited the CFC production of normal CD34+ cells, suggesting an improtant role of PBX1 in regulating normal hematopoesis. RNA-seq data and following validation with several cellular models provided pivotal clues to delineate PBX1 silecing mediated inhibition of CML CD34+ cells.

Keywords: chronic myeloid leukemia; PBX1; CD34+ cells

引言

CML是一类源于正常造血干细胞获得BCR-ABL融合基因的恶性血液肿瘤，其临床表现主要包括髓系细胞大量增生、处于不同分化阶段的粒细胞前体细胞以及已分化的效应细胞的大量积累，外周粒细胞增多症、巨脾、血小板增多症和贫血等[1]。CML患者由慢性期到急变期的转变大概需要3~5年[2]。1960年，Nowell和Hungerford发现大多数CML患者体内含有费城染色体；1973年，Rowley发现费城染色体由9和22号染色体交互易位形成[3]。1990年，Dayley和Baltimore等科学家证实，由t(9;22)(q34;q11)染色体易位形成的融合基因BCR-ABL可恶性转化小鼠骨髓细胞并诱发小鼠的CML样疾病[4]。目前，针对BCR-ABL设计的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）已成为CML慢性期患者的一线治疗药物。然而，部分患者依然会发生疾病复发和药物耐受，这与CML干/祖细胞在患者体内的残存密切相关[5-7]。因此，深入理解CML干/祖细胞的生长与生存机制，鉴定新靶点并研发新疗法仍是CML研究的热点与难点。

部分B细胞急性淋巴细胞白血病患者伴有特异的染色体易位[8-9]，产生E2A-PBX1融合基因。其中，PBX1（pre-B-cell leukemia homeobox 1）编码的产物属于TALE（3-amino acid loop extension）家族的同源盒转录因子，在胚胎发育过程中发挥重要作用[10]。E2A-PBX1在体外可恶性转化小鼠成纤维细胞3T3，但PBX1并不能恶性转化3T3细胞[11-12]。PBX1以多聚蛋白复合体的形式在发育过程中调控基因表达[13-15]。在小鼠模型中，Pbx1缺失可以导致胚胎致死并伴随多种形态模式化形成异常以及脏器发育不良或不全，包括胎肝造血异常[13,16-18]。造血细胞中条件性敲除Pbx1可以使长程造血干细胞（long-term hematopoietic stem cells, LT-HSC）发生渐进性丢失，同时伴随静息态LT-HSC的减少，导致HSC自我更新能力缺陷[19]。PBX1通过直接调控表观调控因子SETDB2或影响细胞信号途径以及重塑细胞内致癌基因信号网络等的形式调控癌细胞增殖[20-22]。本实验室的工作显示CML患者CD34+细胞中PBX1表达显著增高[23]，且PBX1沉默抑制CML细胞的生长并增强其伊马替尼敏感性。然而，PBX1在人类正常造血和CML患者CD34+细胞中的作用机制尚不明确。本论文继续研究PBX1沉默对正常造血细胞和CML细胞的影响，并通过RNA-seq初步探讨其作用机制。

材料和方法

细胞

人慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562，人胚肾上皮细胞293T均购于中国科学院细胞库（中科院分子细胞科学卓越创新中心），健康供体和CML患者骨髓样本由苏州大学附属第一医院血液科提供。

CD34+细胞的分离纯化

1×PBS稀释骨髓样本，混匀后利用等体积的Ficoll分离液分离骨髓单个核细胞；含2% FBS的缓冲液重悬细胞，并利用试剂盒（STEMCELL Technologies）富集CD34+细胞。

细胞培养

K562细胞用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640培养基培养。293T细胞用含10% FBS的DMEM高糖培养基培养；人原代CD34+细胞在含有BIT（STEMCELL Technologies）、β-巯基乙醇、谷氨酸、SCF、Flt-3L、G-CSF、IL-6和IL-3的培养基中培养。以上细胞均在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养。

细胞总RNA提取

收集细胞离心弃上清，1×PBS洗2次；根据微量样本总RNA提取试剂盒（碧云天）中所述方法提取细胞内RNA；-80℃保存。

荧光定量PCR

使用逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA；以β-ACTIN作为内参，使用ABI-7500实时定量PCR仪检测基因表达；采用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量。

病毒的制备

293T细胞以磷酸钙沉淀形式共转染质粒制备慢病毒；用0.22 μm孔径滤器过滤含病毒的培养基，通过超速离心制备浓缩病毒；分装至1.5 mL EP管中后于-80℃保存。

慢病毒侵染细胞

细胞株：根据滴度添加合适体积病毒于细胞中，37℃培养12 h，1×PBS洗涤细胞2次，72 h后利用流式细胞分选仪分选细胞。

原代细胞：纤粘连蛋白fibronectin包被96孔板，根据滴度将适量浓缩病毒均匀地加到包被孔的底部，4℃放置沉降1 h后加入原代细胞，37℃孵育12 h，1×PBS洗涤细胞5次，72 h后利用流式细胞分选仪分选。

蛋白免疫印迹

收集细胞离心弃上清，1×PBS洗2次，加入适量蛋白裂解液裂解细胞，离心收集蛋白上清，BCA蛋白定量；按照所需浓度制备分离胶和浓缩胶；以80 V恒压分离30 min后，160 V分离40 min；400 mA转膜50 min；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；分别孵育一抗、二抗后进行曝光显影。

集落生成实验

细胞株：向1.5 mL甲基纤维素中添加双抗、IMDM培养基和450个细胞，并使终体积为1.65 mL，接种于35 mm皿中，37℃培养，7天后进行集落计数。

原代细胞：向含因子的3 mL甲基纤维素中加入双抗、IMDM培养基和3000个细胞使终体积为3.3 mL，接种于3.5 cm皿中，37℃培养，2周后进行集落计数。

细胞增殖实验

取2×104个细胞种到24孔板中，培养第三天计数，然后再取2×104个细胞继续培养，再过三天进行计数（即第六天的细胞数）。

细胞凋亡检测

收集伊马替尼处理24 h和48 h的K562细胞，1×PBS洗涤2次，7-AAD和Annexin V-PE进行染色后用流式细胞分析仪进行检测。

统计学分析

所有实验均重复3次以上，数据采用GraphPad Prism 5.0处理。结果以mean±SEM表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

实验结果

PBX1沉默增强由伊马替尼诱发的K562细胞凋亡

前期研究表明在CML患者CD34+细胞中PBX1显著高表达，PBX1沉默抑制K562细胞生长并增强其伊马替尼敏感性[23]。本研究中首先证实靶向PBX1的shRNA能有效抑制PBX1的表达，并抑制K562细胞生长（图1）。通过检测细胞凋亡发现，PBX1沉默细胞（shPBX1）较对照细胞（Scramble）具有更多的凋亡细胞（图2A, 2B），这可部分解释PBX1沉默对K562细胞的生长抑制作用。上述细胞经伊马替尼处理后，PBX1沉默组细胞较对照组细胞具有更多的凋亡细胞，48 h后两者的差距经伊马替尼处理后更为明显（图2A, 2B）。与以前报道一致，在含有伊马替尼的CFC检测中，PBX1沉默组细胞所获得的CFC较对照组显著减少（图2C），这些表明PBX1沉默增强CML细胞的伊马替尼敏感性且与细胞凋亡相关。

图1 PBX1沉默抑制K562细胞生长和集落生成能力

Fig. 1 PBX1 silencing inhibits the growth and CFC production of K562 cells

A）Q-RT-PCR检测PBX1的RNA表达（n=3）；B）western blot检测PBX1蛋白表达；C）PBX1沉默对K562细胞生长的影响（n=4）；D）PBX1沉默对K562细胞集落生成能力的影响（n=4）。*代表P<0.05，***代表P<0.001。

图2 PBX1沉默增强K562细胞对IM的敏感性

Fig. 2 PBX1 silencing enhances the sensitivity of K562 cells upon IM treatment

A）流式分析不同时间及浓度IM处理对照和PBX1沉默K562细胞对其凋亡的影响；B）统计不同条件下对照和PBX1沉默K562细胞的凋亡比例（n=4）；C）不同IM处理对照细胞和PBX1沉默K562细胞对其集落生成能力的影响（n=4）；*代表P<0.05，**代表P<0.01。

干扰PBX1抑制正常骨髓CD34+细胞的集落生成能力

条件性基因缺陷小鼠数据显示Pbx1在小鼠造血干细胞以及髓系祖细胞的生长中发挥重要作用[19]。然而，PBX1在人类正常造血中的作用尚不明确。利用慢病毒向人正常骨髓CD34+细胞中递送shRNA，通过FACS分选获取CD34+GFP+细胞，并分析沉默PBX1对正常骨髓CD34+细胞的影响（图3A）。结果显示，沉默PBX1显著降低正常骨髓CD34+细胞的红系和粒巨系集落生成能力，并显著降低总集落生成能力（图3B）。分析对照与PBX1沉默组中集落种类的比例发现，PBX1沉默组中红系集落比例显著下降而粒巨系集落比例显著增多（图3C），反映出红系集落受PBX1沉默抑制较粒巨系更强。

图3 沉默PBX1对正常骨髓CD34+细胞集落生成能力的影响

Fig. 3 Effect of PBX1 silencing on CFC production of CD34+ cells from human normal bone marrow

A）正常骨髓CD34+GFP+细胞的流式示意图；B）沉默PBX1对正常骨髓CD34+细胞集落生成能力的影响（n=6）；C）沉默PBX1对正常骨髓CD34+细胞集落种类的影响（n=6）。*代表P<0.05，**代表P<0.01。

使用RNA-seq初步探究PBX1的作用机制

为深化对PBX1调控CML干/祖细胞作用机制的理解，首先通过FACS分选获得对照和PBX1沉默的CML患者CD34+细胞，取出部分细胞进行CFC检测，证实PBX1沉默发挥预期的生长抑制作用（图4）。其余细胞则被用于RNA提取，并通过RNA-seq建立PBX1沉默和对照CML患者CD34+细胞（n=3）的基因表达谱。使用DEseq软件进行差异分析，默认筛选条件为P<0.05且差异倍数（fold-change）大于2。MA图中红色小点表示显著性差异表达的基因（图5A）。RNA-seq分析共鉴定到184个显著差异表达mRNA和28个lncRNA（图5B, C）。

在后续筛选中，我们关注表达受PBX1沉默而下降的基因。首先，根据文献检索筛选具有促肿瘤细胞生长或增强化疗药物耐受功能的基因。其次，文献显示PBX1结合的保守DNA序列为TGAXT或TGACAG[24-25]；进一步筛选上述基因中启动子区域具有PBX1结合序列的候选基因。最后，我们在不同的细胞模型中对多个候选基因的表达进行检测。结果显示，PBX1沉默可使CML患者CD34+细胞中Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L3（UCHL3）、Fucosyltransferase 8（FUT8）、Mitogen-activated protein kinase associated protein 1（MAPKAP1）和Lysine (K)-specific demethylase 1B（KDM1B）表达显著下降（图5D）。这4个基因在CML患者CD34+细胞中表达较正常供体CD34+细胞显著增高（图5E），提示它们可能具有促CML细胞生长的功能。在K562细胞中，PBX1沉默导致除FUT8外的其他3个基因的显著表达降低（图5F），这将为进一步研究PBX1能否直接转录调控上述几个基因提供便利的细胞模型。

图4 PBX1沉默抑制CML患者CD34+细胞集落生成

Fig. 4 PBX1 silencing suppresses CFC production of CML CD34+ cells

A）沉默PBX1对CML患者CD34+细胞集落生成能力的影响（n=3）；B）沉默PBX1对CML患者CD34+细胞集落种类的影响（n=3）。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

图5 RNA-seq分析PBX1沉默引发的基因差异表达

Fig. 5 Differentially expressed genes upon PBX1 silencing in CML CD34+ cells

A）差异基因的MA图；B和C）沉默PBX1和对照细胞中差异表达的28个lncRNA和156个mRNA（红色/表达上升，绿色/表达降低；n=3）；D）沉默PBX1和对照CML患者CD34+细胞中部分基因的表达差异（n=7）；E）正常骨髓（n=7）和CML患者（n=16）CD34+细胞中部分基因的表达差异；F）沉默PBX1和对照K562细胞中部分基因的表达差异（n=7）。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

讨论

PBX1（pre-B-cell leukemia transcription factor）是属于TALE（three amino acids loop extension）家族的同源盒转录因子（homeodomain transcription factors），可调节包括造血发育、器官形成以及形态模式化在内的多种胚胎发育进程[18-19,26]。Pbx1缺陷小鼠在妊娠期会发生死亡，胎鼠会由于胎肝造血不足引起的贫血。虽然在Pbx1-/-胚肝中存在终末髓系-红系细胞（definitive myeloerythroid lineages），但其集落生成能力降低[19]。此外，PBX1在肿瘤发生和肿瘤复发中也发挥作用[27-28]。然而，尚未有数据报道PBX1在人正常造血发生中的作用。此外，有关PBX1在髓细胞白血病中作用的研究有限，其作用机制尚不明确。

本实验室的前期研究报道PBX1在CML患者CD34+细胞中的表达较正常对照细胞显著升高，可调控这些细胞的生长与伊马替尼反应[23]。与此相似，PBX1促进晚期前列腺癌耐药，通过抑制剂诱导PBX1降解可诱发癌细胞凋亡[29]。在本研究中我们发现PBX1沉默可以增强K562细胞的本底凋亡水平，也使K562细胞更易响应伊马替尼诱发的细胞凋亡。此前，我们的研究显示PBX1过表达可增强正常骨髓CD34+细胞的集落生成能力[23]。本研究中我们则发现PBX1沉默抑制CD34+细胞的集落生成能力，且对红系集落的抑制能力强于对粒巨系集落的抑制能力。这些数据充分显示PBX1在人类造血调控中的重要作用。本研究还建立了患者对照与PBX1沉默CD34+细胞的基因表达谱数据，并进行了初步验证。数据显示UCHL3、FUT8、MAPKAP1和KDM1B等的表达受到PBX1沉默的抑制。由于这些基因的启动子区域都存在PBX1的潜在结合位点，它们也有可能受PBX1的直接转录调控；为继续探索PBX1在CML干/祖细胞中的作用机制提供了良好基础，并可能为改善CML治疗提供新思路。比如，UCHL3编码的蛋白质是去泛素化酶家族的成员。该家族成员是可以去除多肽泛素的蛋白酶，能水解泛素化蛋白的泛素基-N-ε酰胺键，去泛素化的蛋白质将不被蛋白酶体降解。本课题组曾发现该家族的UCHL5在CML患者CD34+细胞中表达较对照细胞显著增高[30]。这可能意味着去泛素化酶在CML干/祖细胞中异常活跃，抑制其活性将为CML的治疗提供新思路。

结论

沉默PBX1可增加K562细胞的本底凋亡水平，并使这些细胞更易发生伊马替尼诱发的细胞凋亡；PBX1沉默显著抑制人正常骨髓CD34+细胞的集落生成能力，显示PBX1是重要的人类造血调控因子；基因表达谱数据和相应的表达验证数据初步揭示PBX1沉默抑制CML干/祖细胞生长的分子机制，为后续研究提供了重要线索。

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基金项目：国家自然科学基金面上项目（31771579）

作者简介：万严（1993-），女，硕士研究生，白血病细胞与分子致病机制研究

通信联系人：赵昀（1973-），男，教授、博导，白血病细胞与分子致病机制. E-mail: zhaoy@suda.edu.cn