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2009年01月19日

李华钟，李寅，林金萍，陈坚**

微生物学报，2001，41（1）：16～24，-0001，（）：

-1年11月30日

以野生型大肠杆菌E. coliⅡ为宿主细胞，转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501，获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳，并且能够重复使用的重组大肠杆菌E. coli Ⅱ21。该菌株经过甲苯处理后，能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽（GSH）。在合成反应体系中，提高L2谷氨酸浓度可促进GSH合成，但L2半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况，提出E. coliⅡ21细胞控制的GSH合成反应机理：由谷胱甘肽合成酶（GSH2Ⅱ）控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP，该反应是整个GSH合成反应的限速步骤，高浓度ADP可能会抑制GSH2 Ⅱ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L2丝氨酸-硼酸钾混合物，可以有效地防止GSH的进一步降解，反应3h后，GSH产量达到2310mmol/L（约711g/L）。

谷胱甘肽,，重组大肠杆菌,，构建,，生物合成,，反应机理

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2009年01月19日

【期刊论文】生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建*

李华钟，李寅，林金萍，陈坚**

微生物学报，2001，41（2）：191～197，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

利用重组大肠杆菌Ⅱ21中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH2J7中的ATP生物合成酶系，构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加1mmol/LAMP和0105mmol/LNADH，即可启动酵母的酵解途径。提高耦合系统中的葡萄糖浓度，可促进GSH的合成。当葡萄糖浓度为400mmol/L时，系统内GSH浓度达到1014mmol/L（312g/L）。Mg2+缺乏时，耦合系统和外加ATP的非耦合系统均不能合成谷胱甘肽。耦合系统中Mg2+与ATP 形成螯合物，可能是导致耦合系统中GSH产量较低的原因。在耦合系统中补加Mg2+，反应6h时GSH浓度达到1413mmol/L（414g/L）。

重组大肠杆菌,，面包酵母,，种间耦合ATP再生系统,，谷胱甘肽,，生物合成,，构建

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2009年01月19日

【期刊论文】弗氏柠檬酸细菌酪氨酸酚解酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

李华钟，孙伟，刘吉泉，陈坚

工业微生物，2001，31（3）：9、01、11，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

以基因组DNA为模板，利用PCR技术从弗氏柠檬酸细菌（Citrobacter freundii）中扩增得到含有酪氨酸酚解酶基因的DNA片段，定向连接到质粒pUC118上，得到重组质粒pTPL，将此重组质粒转化到受体菌E. coli XL-1-BlueMRF中，通过蓝白斑鉴定挑出阳性菌株。从此阳性菌株中提取质粒pTPL并将此质粒转入到E. coli JM109中，用E. coli JM109（pTPL）制备高活性的酪氨酸酚解酶。对质粒稳定性的研究表明，E. coli JM109（pTPL）在无选择压力下37 ℃连续培养50代以上，质粒丢失率仅有15%，说明质粒基本稳定。

Citrobacter freundii， E.， coli， pTPL质粒，酪氨酸酚解酶，质粒稳定性

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2009年01月19日

【期刊论文】酪氨酸酚解酶高产菌株快速筛选模型的建立与应用

李华钟，李静

食品与发展工业，27（4）：61、71、81、91，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

以甲酚红作指示剂，在加有酪氨酸的固态培养基上，根据甲酚红由黄变红所形成的变色圈的大小筛选酪氨酸酚解酶高产突变株是一种平板快速筛选方法。弗氏柠檬酸细菌ATCC8090菌株经紫外线和亚硝基胍诱变处理后，经该法筛选得到突变株C37230，该菌株产酪氨酸酚解酶达125U/g干菌体，较出发菌株提高232%。连续5代传代试验表明，突变株C37230 产酶稳定。

酪氨酸酚解酶，快速筛选方法，弗氏柠檬酸细菌，甲酚红，诱变

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2009年01月19日

【期刊论文】重组大肠杆菌合成左旋多巴条件的优化

李华钟，孙伟，王树英，陈坚

工业微生物，2002，32（2）：5～9，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

通过对合成体系各组分对产物形成的影响的研究，分别求得了底物邻苯二酚、丙酮酸及乙酸氨的表观米氏常数、表观底物抑制常数和最适底物浓度，并得出合成左旋多巴的最适反应体系为：1%丙酮酸，1.2%邻苯二酚，2%乙酸铵，0.1%EDTA，0.2%亚硫酸钠，用氨水调pH至8.0。加入从与合成体系等体积培养液中收获的重组大肠杆菌细胞，于15℃反应16h，L-DOPA 的产量为15.36g/L。

左旋多巴，合成，优化，重组大肠杆菌

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