To produce an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae that metabolizes xylose, we constructed a rDNA integration vector and YIp integration vector, containing the xylose-utilizing genes, XYL1 and XYL2, which encode xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) from Pichia stipitis, and XKS1, which encodes xylulokinase (XK) from S. cerevisiae, with the G418 resistance gene KanMX as a dominant selectable marker. The rDNA results in integration of multiple copies of the target genes. The industrial stain of S. cerevisiae NAN-27 was transformed with the two integration vectors to produce two recombinant strains, S. cerevisiae NAN-127 and NAN-123. Upon transformation, multiple copies of the xylose-utilizing genes were integrated into the genome rDNA locus of S. cerevisiae. Strain NAN-127 consumed twice as much xylose and produced 39% more ethanol than the parent strain, while NAN-123 consumed 10% more xylose and produced 10% more ethanol than the parent strain over 94h.

在酿酒酵母中分别引入真菌和细菌的木糖代谢关键酶，木糖还原酶基因XYL1、木糖醇脱氢酶基因XYL-和木糖异构酶基因xylA。并在此基础上以共转化策略超表达下游关键酶木酮糖激酶基因XKS1。与亲本菌株相比，用pMA91和YEp24质粒表达XKS1的重组菌株，木酮糖激酶（xylulokinase, XK）活性分别提高了14和617倍。在限氧条件下，重组菌株对木糖和葡萄糖的共发酵结果显示，表达XYL1，XYL2以及XKS1的重组菌株HSXY2251木糖消耗为1214g/L，提高了12019%，乙醇产量达到914g/L，提高了36%，副产物木糖醇产量为017g/L，下降了8419%。

途径工程（Pathway engineering），被称为第三代基因工程，改变代谢流向，开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。利用途径工程理念，对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）代谢途径进行理性设计，以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围，使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分，是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一。这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展。

根据代谢工程原理，采取多拷贝整合策略，利用整合载体pYMIKP，将来自嗜热细菌Thermus therm ophilus的木糖异构酶（XI）基因xylA和酿酒酵母（Saccha rom yces cerevisiae）自身的木酮糖激酶（XK）基因XKS1，插入酿酒酵母工业菌株NAN227的染色体中，得到工程菌株NAN2114。酶活测定结果显示，NAN2114中XI和XK的活性均高于出发菌株NAN227，表明外源蛋白在酿酒酵母工业菌株中得到活性表达。对木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明，工程菌NAN2114消耗木糖4.6g/L，产生乙醇6.9g/L，较出发菌株分别提高了43.8%和9.5%。首次在酿酒酵母工业菌株中建立了XI路径的木糖代谢途径。

根据酵母整合质粒的设计要求，PCR扩增特定的2.2kb rDNA片段，并以此替换酿酒酵母（Saccharomyces cerevi-siae）整合载体YIp5的URA3片段；在此基础上，引入G418抗性基因KanMX和酵母磷酸甘油激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）组成型强启动子和终止子序列（PGKp2t），构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体pYMIKP。以细菌木糖异构酶（xylose isomerase，XI）基因xylA为目标基因，通过载体pYMIKP引入到酵母工业菌株NAN227中。酵母转化子在非选择培养条件下，连续生长50世代质粒稳定性为99.72%。目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的67.2倍，达到0.672UPmg蛋白，实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达。