High-throughput paired-end RNA sequencing (RNA-Seq) was performed to investigate the gene expression profile of a susceptible Bombyx mori strain, Lan5, and a resistant B. mori strain, Ou17, which were both orally infected with B. mori cypovirus (BmCPV) in the midgut. There were 330 and 218 up-regulated genes, while there were 147 and 260 down-regulated genes in the Lan5 and Ou17 strains, respectively. Gene ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment for differentially expressed genes (DEGs) were carried out. Moreover, gene interaction network (STRING) analyses were performed to analyze the relationships among the shared DEGs. Some of these genes were related and formed a large network, in which the genes for B. mori cuticular protein RR-2 motif 123 (BmCPR123) and the gene for B. mori DNA replication licensing factor Mcm2-like (BmMCM2) were key genes among the common up-regulated DEGs, whereas the gene for B. mori heat shock protein 20.1 (Bmhsp20.1) was the central gene among the shared down-regulated DEGs between Lan5 vs Lan5-CPV and Ou17 vs Ou17-CPV. These findings established a comprehensive database of genes that are differentially expressed in response to BmCPV infection between silkworm strains that differed in resistance to BmCPV and implied that these DEGs might be involved in B. mori immune responses against BmCPV infection.

【目的】通过对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）胁迫的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）及免疫通路进行深入细致的分析，揭示宿主的细胞和体液免疫应答，为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T）转录组数据，按照FDR≤1，P≤0.05和|log2 fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG，利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析，进而对免疫通路富集基因进行统计和分析，利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）验证转录组数据的可靠性。【结果】 差异分析结果显示，Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因；Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示，两个比较组特有的DEG分别为739和853个，共有的DEG为118个。GO分类结果显示，Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目，其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程；富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目，其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性；富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示，Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路，富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路；富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体；涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路，以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路，富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢；富集下调基因数最多的前5条分别为mRNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢；涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路，以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-qPCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致，证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活，随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成，体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答，揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答，前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用；宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强，但体液免疫较大程度地减弱；泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG，NF-κB信号通路及富集DEG，以及apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin编码基因可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。

【目的】微小RNA（microRNA，miRNA）是一类重要的基因表达调控因子，可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析，在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答，并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道（AmCK和AmT）进行高通量测序，首先对原始数据进行质控和评估，随后将过滤后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对；将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库，得出已知miRNA的表达量；通过TPM（tags per million）算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理，以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA；利用TargetFinder 软件预测显著DEmiRNA的靶基因，并对其进行GO和KEGG代谢通路（pathway）富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后，利用茎环反转录PCR（Stem-loop RT-PCR）和荧光定量PCR（qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段（raw reads），经严格过滤后得到的有效读段（clean reads）数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA，包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因，其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目，主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等；下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目，主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示，上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路，富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA，分别有31和52个靶基因注释到内吞作用，15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解，11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路，1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络，7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA，8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析，并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络，研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息，揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控，可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。

蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis特异性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病。本研究利用RNA-seq技术对球囊菌菌丝和孢子进行深度测序，基于高质量的转录组数据对已注释基因进行结构优化，对未注释基因进行预测、鉴定和分析。本研究通过将测序得到的clean reads比对参考基因组和转录本重构，共对101个已注释基因的5'端或3'端进行了延长；利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对，共鉴定出373个新基因，随机挑选10个新基因进行RT-PCR验证，8个能扩增出符合预期的目的片段，表明预测出的多数新基因真实存在。进一步分析结果显示有147个球囊菌新基因可注释到Nr和eggNOG数据库中；85个新基因富集在29个GO条目；66个新基因富集在33条代谢通路；上述结果表明本研究预测出的新基因可能在球囊菌的新陈代谢和细胞生命活动中发挥重要作用。研究结果为球囊菌的基因结构和功能注释信息提供了有益补充，也为新基因的功能研究打下了初步基础。

【目的】蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，简称球囊菌）是一种能够侵染中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）幼虫的致死性真菌病原。微小RNA（microRNA，miRNA）可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析，进而揭示DEmiRNA在蜜蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道（AcCK和AcT）进行测序，通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNAs的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA，其长度分布介于16 ~35 nt之间，且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA，包含31个上调和23个下调miRNA，可分别靶向结合6170 和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目，富集基因数最多的皆为结合、细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路（pathway）富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway，富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明，DEmiRNA及其靶mRNAs形成十分复杂的调控关系；31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs，18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNAs；miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后，随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证，结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息，揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御，miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。