【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序，de novo组装球囊菌的参考转录组，并对其进行功能与代谢通路注释，进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子，配制含1×107孢子/mL的饲料饲喂4, 5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫，通过Illumina HiSeqTM 2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序，原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes，进而通过BLASTX比对NCBI Nr, Swiss-Prot, KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索，并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物，通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads，de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示，29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多，达6 050个。KEGG注释结果显示，unigenes可注释到117个代谢通路，其中富集在核糖体（ribosome）上的unigenes数量最多（529）。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs，通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组，并进行了功能与代谢通路注释，可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。

【目的】本研究利用small RNA-seq技术对球囊菌的纯培养进行测序，对球囊菌的microRNAs(miRNAs)进行预测、鉴定和分析，进而构建miRNAs-mRNAs的调控网络。【方法】利用Illumina Hiseq Xten平台对球囊菌菌丝与孢子进行测序，通过相关生物信息学软件对球囊菌的miRNAs进行预测和分析，通过茎环(Stem-loop)PCR对部分miRNAs进行鉴定，利用Cytoskype软件构建miRNAs-mRNAs的调控网络。【结果】本研究共获得48268696条clean reads，预测出118个球囊菌的miRNAs，它们的长度分布介于18–25 nt之间，不同长度的miRNA的首位碱基偏好性差异明显。Stem-loop PCR验证结果显示共有10个miRNAs能够扩增出符合预期的目的片段，说明多数miRNAs可能真实存在。共预测出6529个球囊菌miRNAs的靶基因，其中的5725个能够注释到Nr、Swissprot、KOG、GO和KEGG数据库。进一步分析结果显示有24个靶基因注释在MAPK信号通路。Cytoskype软件分析结果显示球囊菌的miRNAs与mRNAs之间存在复杂的调控网络，绝大多数的miRNAs处于调控网络的内部且同时结合多个mRNAs。【结论】本研究率先对球囊菌的miRNAs及miRNAs-mRNAs调控网络进行全面分析，研究结果丰富了对球囊菌miRNAs的认识，为其基础生物学信息提供了有益补充，也为阐明球囊菌致病的分子机理打下了一定基础。

蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis特异性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病。本研究利用RNA-seq技术对球囊菌菌丝和孢子进行深度测序，基于高质量的转录组数据对已注释基因进行结构优化，对未注释基因进行预测、鉴定和分析。本研究通过将测序得到的clean reads比对参考基因组和转录本重构，共对101个已注释基因的5'端或3'端进行了延长；利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对，共鉴定出373个新基因，随机挑选10个新基因进行RT-PCR验证，8个能扩增出符合预期的目的片段，表明预测出的多数新基因真实存在。进一步分析结果显示有147个球囊菌新基因可注释到Nr和eggNOG数据库中；85个新基因富集在29个GO条目；66个新基因富集在33条代谢通路；上述结果表明本研究预测出的新基因可能在球囊菌的新陈代谢和细胞生命活动中发挥重要作用。研究结果为球囊菌的基因结构和功能注释信息提供了有益补充，也为新基因的功能研究打下了初步基础。

【目的】本研究旨在通过趋势分析对胁迫意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica（简称意蜂）幼虫肠道的球囊菌Ascosphaera apis的差异表达基因（DEGs）进行转录组分析。【方法】将纯化的球囊菌孢子配制为1×107孢子/mL的饲料饲喂意蜂3日龄幼虫，利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道cDNA进行测序，将过滤得到的有效读段（clean reads）映射（mapping）到核糖体数据库及mapping意蜂参考基因组，最后mapping到本课题组组装并注释的球囊菌参考转录组。利用STEM软件对DEGs进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。最后，通过对随机选取6个DEGsd的RT-qPCR分析对RNA-seq数据进行验证。【结果】球囊菌胁迫意蜂幼虫肠道样品的Illumina测序共得到球囊菌的25 454 076条原始读段（raw reads），经过滤得到24 909 820条clean reads，Q30均在93.46%以上。趋势分析结果显示，19 893个DEGs聚类为8个表达模式，其中有12 151个DEGs聚类为3个表现为显著上调趋势的表达模式。GO富集分析结果显示，表现上调趋势的DEGs富集在40个GO term，富集基因数最多的为细胞进程（cellular process）（2 601 unigenes），其次为代谢进程（metabolic process）（2 553 unigenes）和细胞（cell）（2 522 unigenes）。KEGG代谢通路富集分析结果显示，上调趋势中的DEGs富集在119个代谢通路上，其中富集基因数最多的是核糖体（ribosome）（213 unigenes），其次为氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）（154 unigenes）和内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）（130 unigenes）。共有48个DEGs富集在MAPK信号通路上，聚类分析结果显示，这些DEGs随着胁迫时间的延长表达水平逐渐增强。RT-qPCR结果显示，6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致，证明了本研究中的转录组数据真实可靠。【结论】本研究为在分子水平揭示球囊菌的致病机理提供了重要信息，也为阐释球囊菌胁迫意蜂幼虫过程中的病原-宿主互作机制奠定了基础。

【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂（中蜂）幼虫肠道进行深度测序，经趋势分析得到差异表达基因（DEG）的显著表达模式，进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序，将有效读段（clean reads）先映射定位（mapping）核糖体数据库，再mapping中蜂幼虫肠道参考转录组，过滤后的clean reads 进而mapping球囊菌参考转录组。利用STEM软件对胁迫过程中球囊菌的基因表达模式进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路（pathway）富集分析。最后，通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行验证。【结果】本研究中，经过滤得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式，其中，16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果表明，显著上调与显著下调趋势中的DEGs富集于40与37个GO term，基因富集数最多的为细胞进程（cellular process）（2486 unigenes）和细胞（cell）（708 unigenes）。KEGG pathway富集分析显示显著上调与显著下调趋势中的DEGs富集在119和112个pathway上，基因富集数量最多的是氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）（127 unigenes）与核糖体（ribosome）（98 unigenes）。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖，而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。共有11个DEGs富集在MAPK信号通路，它们的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降，推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。RT-qPCR结果显示6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致，证明了本研究中转录组数据的可靠性。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息，也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。