【目的】预测、分析和鉴定意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂肠道的长链非编码RNA（lncRNA），探究lncRNA的作用。【方法】结合RNA-seq技术和链特异性cDNA建库方法对意蜂工蜂中肠进行深度测序；利用Perl脚本对原始数据进行过滤；联用CPC和CNCI软件对测序数据进行lncRNA预测，并比较lncRNA基因与其邻近的蛋白编码基因的结构特征；通过RT-PCR对随机选取的lncRNA进行鉴定；利用相关生物信息学软件对lncRNA、的上下游基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析。【结果】意蜂工蜂中肠样品的lncRNA-seq共得到1 956 118 858原始读段，经过滤得到1 946 489 304有效读段，共预测出6 353个lncRNA，它们较蛋白编码基因含有较少的外显子数、较短的转录本长度。通过RT-PCR验证了9个lncRNA的表达。lncRNAs的上下游基因富集在42个GO条目和256条代谢通路，进一步分析结果表明这些lncRNAs参与调控意蜂工蜂中肠的新陈代谢和细胞生命活动等生物学过程。【结论】研究结果丰富了蜜蜂的lncRNA信息，也为阐明lncRNA在意蜂工蜂中肠发育及胁迫响应过程中的作用打下了基础。

【目的】微小RNA（microRNA，miRNA）是一类在转录后水平对mRNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在通过分析意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）幼虫肠道发育过程中差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）及其调控网络，提供miRNA的表达谱和差异表达信息，揭示DEmiRNA在幼虫肠道发育中的作用。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道样品（Am4、Am5和Am6）进行测序，将质控后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对，然后将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库，并利用TPM（tags per million）算法归一化处理所得miRNA的表达量，再通过相关生物信息学软件对miRNA进行表达量聚类、前体二级结构预测及差异表达分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNA的靶基因，使用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库注释，进而通过Cytoscape软件构建miRNA-mRNA的调控网络。采用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序分别得到10 841 644、14 655 839和9 230 496条有效序列标签；Am4 vs Am5比较组包含16个上调和10个下调miRNA，Am5 vs Am6比较组包含5个上调和7个下调miRNA。其中，novel-m0031-3p为两个比较组所共有，并结合5个与蜕皮激素诱导蛋白相关的靶基因;二者的特有DEmiRNA数分别为25和11个。Am4 vs Am5的26个DEmiRNA结合5 742个靶基因，其中2 725个靶基因可注释到GO数据库中的46个GO term，并主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和单组织进程等；Am5 vs Am6的12个DEmiRNA结合3 733个靶基因，且其中2 725个靶基因富集在结合、细胞进程、单组织进程和代谢进程等41个GO term；此外，两个比较组中的DEmiRNA分别有1 046和676个靶基因可注释到116和92条KEGG代谢通路，且Am4 vs Am5比较组的DEmiRNA的靶基因富集在Wnt信号通路、Hippo信号通路、嘌呤代谢和内吞作用等通路上的数量均高于Am5 vs Am6比较组。进一步分析结果显示Am4 vs Am5中的上调和下调miRNA可分别结合611和85个靶基因，其中ame-miR-6052结合的靶基因数最多，可通过结合5个靶基因,参与对细胞色素P450的调控；miR-281-x结合49个靶基因,并间接调控组氨酸代谢、TGF-β信号通路以及Hippo信号通路；Am5 vs Am6中的上调和下调miRNA可分别结合43和431个靶基因，其中miR-iab-4-x结合靶基因数量最多，并广泛参与调控背腹轴的形成、Hippo信号通路、Wnt信号通路、FoxO信号通路、Notch信号通路以及mTOR信号通路等与生长发育相关的通路。调控网络分析结果表明，DEmiRNA与靶基因间形成较为复杂的调控网络，DEmiRNA居于调控网络的中心位置，而mRNA位于调控网络的外周。最后，通过茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）对随机选取的3个DEmiRNA进行验证，结果证实了测序数据的可靠性。【结论】在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析，并对DEmiRNA的调控网络进行构建及分析，发现意蜂幼虫通过调节包括ame-miR-6052、miR-iab-4-x、miR-281-x和novel-m0031-3p在内的多个miRNA的表达水平对肠道生长和发育进行调控，研究结果不仅提供了意蜂肠道发育过程的miRNA表达谱及差异表达信息，也为阐明意蜂幼虫肠道的发育机理打下了基础。

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是专性寄生蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌，对意大利蜜蜂(意蜂)具有较强的侵染性。本研究利用 ＲNA-seq 技术对正常 10 d ( Apis mellifera ligustica control group，AmCK)和N. ceranae胁迫10 d的意蜂工蜂中肠(Apis mellifera ligustica treatment group，AmT)进行测序，共得到160 847 237 100 条原始读段， 过滤后得到 1 066 955 298 条有效读段。主成分分析结果显示 AmCK 与 AmT 测序样品的组内重复性较好， 组间的基因表达模式差异明显。GO 分类结果显示， AmCK与AmT的前100 位高表达基因( HEGs)分别分布于32和33个GO terms， 基因富集数最多的均为代谢进程。KEGG 代谢通路(pathway)富集分析结果显示，AmCK的前100位HEGs富集在21个pathways，基因富集数最多的是内吞作用、信号通路和嘌呤代谢; AmT的前100 位 HEGs 富集在26个pathways，基因富集数最多的是内吞作用、ＲNA 转运和蛋白质的内质网加工。前100位HEGs的Venn分析结果显示AmCK与AmT的共有HEGs为87个，特有HEGs分别均为13个。研究结果揭示了N. ceranae胁迫意蜂工蜂中肠过程中的基因表达谱信息，也为解析N. ceranae致病的分子机理提供了有益信息和线索。

Nosema ceranae is a unicellular fungal parasite of honey bees and causes huge losses for apiculture. Until present, no study on N . ceranae long non-coding RNAs (lncRNAs) was documented. Here, we sequenced purified spores of N . ceranae using strand-specific library construction and high-throughput RNA sequencing technologies. In total, 83 novel lncRNAs were predicted from N . ceranae spore samples, including lncRNAs, long intergenic non-coding RNAs (lincRNAs), and sense lncRNAs. Moreover, these lncRNAs share similar characteristics with those identified in mammals and plants, such as shorter length and fewer exon number and transcript isoforms than protein-coding genes. Finally, the expression of 12 lncRNAs was confirmed with RT-PCR, confirming their true existence. To our knowledge, this is the first evidence of lncRNAs produced by a microsporidia species, offering novel insights into basic biology such as regulation of gene expression of this widespread taxonomic group.

【目的】长链非编码RNA（lncRNA）在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica, 简称意蜂）工蜂肠道发育过程中lncRNAs的表达谱及其作用。【方法 】本研究利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7 d和10 d工蜂肠道（Am7, Am10）进行深度测序，下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库，进一步利用TopHat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNAs进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNAs（DElncRNAs）分析，进而预测lncRNAs的上下游基因，并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和TargetScan软件预测DElncRNAs靶向结合的miRNAs及miRNAs靶向结合的靶基因，并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-miRNAs-mRNAs的调控网络。最后，通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】Am7和Am10的深度测序分别获得147 051 470和134 802 058条原始读段，经严格过滤分别得到160 844 082和160 537 248条有效读段；共得到3 890个DElncRNAs，包括2 005个上调lncRNAs与1 885个下调lncRNAs。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNAs能扩增出符合预期的目的片段，表明预测出的lncRNAs真实存在。DElncRNAs的上下游基因数为1 793个，它们涉及42个GO条目，包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等；这些上下游基因还涉及251条代谢通路，包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路，硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路， Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路，溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路，以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路，上述结果表明DElncRNAs 在意蜂肠道发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS_00020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥调控功能。DElncRNAs的调控网络分析结果显示DElncRNAs与miRNAs、mRNAs间存在复杂的调控关系，部分DElncRNAs处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的miRNAs，也有部分miRNAs可被多个DElncRNAs共同靶向，表明这些DElncRNAs可能在肠道发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNAs进行RT-qPCR验证，结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致，证实了本研究测序数据的可靠性。【结论 】率先对意蜂工蜂肠道发育过程中的lncRNAs及其功能进行深入分析，研究结果提供了意蜂工蜂肠道发育过程中的DElncRNA信息，揭示了DElncRNAs广泛参与意蜂工蜂肠道的新陈代谢、细胞活动和免疫调控以及作为竞争性内源RNA（ceRNA）发挥作用，也为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。