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李庆阁, Qing-Ge LI, *† Ji-Xuan LIANG, ** Guo-Yan LUAN, *** Yang ZHANG, *** and Kun WANG***
ANALYTICAL SCIENCES FEBRUARY 2000, VOL. 16,-0001,():
-1年11月30日
A rapid and simple homogeneous fluorescence PCR assay was developed for the clinical diagnosis of infectious diseases based on a molecular beacon. The established method could reproducibly detect Mycobacterium tuberculosis at the 10 bacteria/mL level. The analytical specificity was tested with 14 strains of mycobacterium, four unrelated bacteria and 220 negative samples; no false positive results were obtained. A blind test was also performed to evaluate its performance in Mycobacterium tuberculosis diagnosis. The results showed that both the clinical sensitivity and the specificity were 100%, and that the detection limit was in the range of 1-10 bacteria/ml. A clinical study with 466 patient samples demonstrated that fluorescence PCR assay correlated well with smear (93.6%) and culture (98.4%) methods for positive samples. However, fluorescence PCR could detect positive samples (62.9%) more than smear (30.3%) and culture (31.4%), indicating a higher sensitivity of the present method than the traditional ones. The feasibility of this method was further approved by successful detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis.
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李庆阁, 扈庆华, 郑薇薇, 石晓路, 王冰, 庄志雄, 刘小立, 贺连华, 吴平芳
中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(12):1004~1007,-0001,():
-1年11月30日
目的建立改良分子信标2双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR2改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标2双重实时PCR 反应体系DNA灵敏度为102.4~166.6fgPμl,菌液灵敏度为32~64CFUPml或3~6CFUPPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标2双重实时PCR 检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。
霍乱弧菌, 副溶血弧菌, 改良分子信标, 双重实时PCR, 同步检测
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引用
【期刊论文】双链置换探针实时PCR用于DNA池的等位基因频率测定
李庆阁, 程金平, 梁基选, 李庆阁*
厦门大学学报(自然科学版),2004,113~118,-0001,():
-1年11月30日
结合荧光双链置换探针的特异性和实时PCR的准确定量能力,建立了一种新颖、准确、价廉且高通量的测定DNA池等位基因频率的方法,该方法采用不同荧光标记的双链置换探针1次PCR反应即可测定出等位基因频率,实验以β-地中海贫血CDs41-42(-TCTT)突变为对象 分别用荧光染料FAM和ROX标记野生型和突变型探针,由实时CR检测建立的等位基因浓度与循环阈值的响应曲线计算DNA池的等位基因频率,结果表明,建立的系列等位基因浓度与循环阈值呈线性关系,线性相关系数分别为0.9977(野生型等位基因)和0.9938(突变型等位基因),可检测的最低等位基因频率达1%等位基因频率在1%~90%范围内测定误差小于4%该方法可广泛用于流行病学调查、遗传连锁分析以及全基因组连锁不平衡扫描等领域。
双链置换探针, 实时PCR, DNA池, 等位基因频率
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李庆阁, 张永有, 栾国彦, 梁基选
HE REDITAS (Beijing) 25 (1): 9~13, 2003,-0001,():
-1年11月30日
以荧光染料Eam和Joe分别标记野生型和突变型双链探针作为均相检测探针,以构建的DNA模板作为研究模型 采用固定波长差同步荧光分析法对PCR反应产物进行终点检测,通过对HFE基因C282Y点突变的检测,并以限制性内切核酸酶Rsa1证实,该方法是一种廉价、快速、可靠的筛查遗传性血色病基因C282Y突变的方法,该法可扩展到各种基因的突变检测。
遗传性血色病, 双链探针, 同步荧光, 基因突变筛查
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引用
李庆阁, 扈庆华, 郑薇薇, 石晓路, 叶宝英, 王冰, 庄志雄, 刘小立
CHfNA TROPlCAL MEDICINE Vol. 4 No.4 Angnst 2004,-0001,():
-1年11月30日
目的建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法,应用于霍乱监测。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,并进行特异性和灵敏度分析; 同时以11种细菌作对照,建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系,应用于霍乱监测。结果霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌,只有霍乱弧菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为102.4fg/ul,菌液灵敏度为32cfu/ml或3cfu反应体系,对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测,结果都为阴性。检测时间仅需2h结论改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱的快速诊断,为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。∀
霍乱弧菌, 改良分子信标, 实时PCR, 快速检测
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