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2009年10月21日

王一飞，熊盛，邢少璩，邓宁，张美英，陈文吟，饶桂荣，粟宽源，余宙耀

中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（5）：356～359，-0001，（）：

-1年11月30日

目的研究重组人源抗HBsAg单链抗体（HBscFv）在HBV转基因小鼠体内的活性作用，探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性。方法工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后，分步透析复性。复性后的HBscFv（0.9g/L）经尾静脉注射HBV转基因小鼠，一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度，计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比（结合率），同时以人血源HBsAb IgG（40U/ml）和生理盐水作为对照。结果两步纯化获得纯度达到98%的重组HBscFv。HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg，其结合率为（30.47±9.85）%，与生理盐水组差异有显著性（P<0.001），与HBsAb IgG组差异无显著性（P>0.05）；对照品HBsAb IsG的结合率为（39.00±7.43）%，与生理盐水组差异也有显著性（P<0.001）。比较HBscFv和HBsAb IgG的结合率及其浓度，求得HBscFv的结合效价为31.58U/mg。结论 HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性，HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAs特异性抗体的体内结合活性的候选模型。

转基因小鼠，乙肝病毒，单链抗体，结合活性，体内

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2009年10月21日

【期刊论文】Immune responses in Balb/c mice induced by a candidate SARS-CoV inacivated vaccine prepared from F69 strain

王一飞， Chuan-hai Zhang a， b， f， Jia-hai Lu c， **， Yi-fei Wang a， Huan-ying Zheng e， Sheng Xiong a， Mei-ying Zhang a， Xin-jian Liu a， Jiu-xiang Li a， Zhuo-yue Wan e， Xin-ge Yan e， Shu-Yuan Qi f， Zhiyong Cuig， Biliang Zhang d， g， *

C.-h. Zhang et al./Vaccine23(2005)3196-3201，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

The immunogenicity of a candidate-inactivated vaccine prepared from SARS-CoV F69 strain was evaluated in Balb/c mice. Potent humoral immune responses were induced under the elicitation of three times of immunizations at 2-week intervals with this vaccine, combined with three types of adjuvants (Freunds adjuvant, Al(OH)3 adjuvant and CpG adjuvant). Titers of specific IgG antibodies in three test groups all peaked in the sixth week after first vaccination, but significant differences existed in the kinetics of specific IgG antibody levels. The strong neutralizing capacity exhibited in micro-cytopathic effect neutralization tests indicated the specific antibodies are protective. Western blot assay further demonstrated the specificity of the induced serum antibodies.

SARS coronavirus (， SARS-CoV)，， Inactivated vaccine， Immunogenicity， Balb/， c m]ouse

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2009年10月21日

【期刊论文】pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

王一飞，董晓，王家宁黄永章郭凌郧

郧阳医学院学报，2005，24（6）：321～325，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

目的：利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP，在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法：以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应（PCR）的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列，利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷（dATP）反应，在EGFP序列两3’端加“ ，将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5ct，经蓝白筛选，挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定，正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP用XhoI和BamH1分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b，低熔点琼脂糖回收EGFP eDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连，转化感受态大肠杆菌DH5ct并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序，获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基p-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）进行N一树脂柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结杲：经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP eDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP eDNA序列完全一致，从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BI21（DE ）并经诱导后得到高效表达，表达量可达66me，/100ml菌液，SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论：表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。

TA克隆载体，增强型绿色荧光蛋白(， EGFP)，，重组质粒，蛋白表达，蛋白纯化

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2009年10月21日

【期刊论文】灭活SARS病毒的纯化鉴定及初步应用

王一飞，钱垂文，熊盛，张关英，陆家海，张传海，李久香，万卓越，郑焕英，张庶民

现代免疫学，2005，25（2）：152～154，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

为制备纯化的灭活SARS病毒，取广东省CDC提供的灭活SARS-CoV病谳培养液进行超滤，收集相对分子质量介于100000至500000之间的组分。并浓缩。对纯化过程中各组分进行抗原活性签定和蛋白质含量测定。并加佐剂后免疫动物，测定抗体免疫应答。结果表明：超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%，纯化倍数为9，抗原活性达到1∶480 免疫家免获得的血清ELISA效价达到1∶10000以上，中和抗体效价达到1∶2000以上。表明该纯化工艺能获得较高纯度的灭活SARS-CoV病毒颗粒。

SARS-CoV，纯化， ELISA，免疫应答

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2009年10月21日

【期刊论文】达NM23-HI/NDPK-A工程菌的遗传稳定性研究*

王一飞，钱垂文，黄立，王一飞**，熊盛，张美英，李雪玲

中国生物工程杂志，2005，25（2）：35～38，-0001，（）：

-1年11月30日

摘要

目的：研究重组工程菌的遗传稳定性。方法：利用重组表达质粒pBVNM-HI转化宿主菌E.coli DI-LSa，筛选重组工程菌DH5a-pBVNM-HI。将新构建好的重组工程菌在无选择压力的条件下进行连续传代培养，比较菌落在LB（-）和LB（+）培养基上的生长状况，并对传代菌株目标蛋白的表达情况以及质粒数量和目的基因DNA进行电泳鉴定。结果：重组工程菌连续传代5O次中，在LB（-）和LB（+）培养基上的生长状况相同，目标蛋白表达量无显著差异，质粒数量及目的基因DNA结构稳定。结论：重组工程菌DH5a-pBVNM.HI具有良好的遗传稳定性。

pBVNM-HI DH5a-pBVNM-HI 遗传稳定性

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