目的 研究人类疱疹病毒8型（HHV-8）开放读码框架（ORF）50基因启动子在HIV-1感染相关细胞因子肝细胞生长因子/驱散因子（HGF/SF）诱导原发性渗出性淋巴（PEL）BC-3中潜伏感染的HHV-8复制过程中的作用。方法 将HGF/SF连续加入到体外培养的BC-3中，分别于培养第3天和第7天收集刺激细胞，电子显微镜观察成熟HHV-8病毒的形成；提取细胞总RNA，North-ernblot和定量聚合酶链反应（PCR）法检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26mRNA转录。同时，将已构建的HHV-80RF50启动子+虫荧光紊酶报告基因重组质粒和含HIV-1Tat基因重组表达质粒分别共转染BC-3和人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs），转染后24h加入HGF/SF和/或重组HIV-1gp120刺激，刺激后24h收集细胞，进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯（TPA）刺激为阳性对照。结果 HGF/SF可以上调HHV-80RF26mRNA表达，且于刺激的第7天，ORF26mRNA表达上升了4.1倍，BC-3细胞中同时可观察到成熟的HHV-8病毒粒子；HGF/SF能够诱导ORF50启动子活性，但HIV-1Tat和gp120蛋白与HGF/SF协同上调ORF50启动子活性的能力较弱。结论 HIV-1感染相关细胞因子HGF/SF诱导HHV-8复制的过程至少有部分由ORF50启动子介导。

目的 构建含HIV-1Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出，插入到表达质粒LZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细phoenix（ΦNX）中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化（IHC）染色检查Tat在临时转染和稳定转染ΦNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Westernblot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞（HeLa-HIV-1-LTR/CAT报告基因）中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染ΦNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平；②临时转染病毒感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。

目的 证实卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）K12基因在体外可以转化小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞，体内可以诱导肿瘤的形成。方法 采用PCR法构建含KSHVK12基因的重组反转录病毒表达质粒，将该质粒转染NIH3T3细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞。采用软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验，分别证实K12基因体外转化细胞和体内致瘤特性。免疫组化（IHC）染色进一步评价转化细胞及其诱导的肿瘤组织中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、Fas和FasL的表达水平。结果 K12基因转化的NIH3T3细胞在软琼脂中可以形成集落、在裸鼠体内可以形成肿瘤；转化的细胞及其诱导的肿瘤组织中可观察到VEGF、Fas和FasL的表达，其中，Fas和FasL的表达较高。结论 KSHVK12基因具有体外转化细胞、体内诱导肿瘤形成的能力。

采用分子克隆技术构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV）转化基因K12和含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因重组逆转录病毒表达质粒，分别命名为LZRS-K12和pLXSN-Fcy:Fur。将LZRS-K12质粒转染NIH3T3细胞系，诱导细胞转化获得具有肿瘤细胞生物学特性的N/K12细胞，进一步将pLXSN-Fcy:Fur质粒转染N/K12细胞，获得含CD基因的N/K12/FF细胞。加入5-氟胞嘧啶（5-FC）后，采用MTT法、流式细胞仪和免疫组化（IHC）等方法，分别检测细胞存活率、凋亡率及凋亡相关蛋白的表达。结果显示，N/K12/FF细胞在使用5-FC后存活率明显下降。流式细胞仪检测结果显示，5-FC作用后的N/K12/FF细胞的凋亡率与作用前相比增加了4.6%。与此同时，经5-FC作用后的N/K12和N/K12/FF细胞的生长周期发生了明显变化，均表现为G0-G1期细胞比率降低，S和G2-M期细胞比率增高。5-FC使得N/K12细胞的增殖主要阻滞在G2-M期，而N/K12/FF细胞的增殖主要阻滞在S期。IHC检测结果表明，N/K12细胞在5-FC使用前后Fas和Fas-L表达改变均不明显；而N/K12/FF细胞在5-FC使用后的Fas和Fas-L表达水平均明显高于5-FC使用前的水平。提示，CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞具有杀伤作用；凋亡有可能介导了部分杀伤过程；Fas和Fas-L有可能部分参与凋亡的诱导。

目的 研究HIV-1感染中相关细胞因子IFN-γ对人类疱疹病毒8型（HHV-8）Rta基因启动子活性影响；评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性。方法 将已构建的HHV-8Rta启动子+虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV-1Tat基因重组表达质粒转染多种细胞，转染后24h加入IFN-γ和/或重组HIV-1gp120刺激，刺激后24h收集细胞，进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照，进行最佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较。结果 ①HHV-8Rta启动子启动活性在TPA刺激后的24h达到最高峰；②HHV-8Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV-8和/或EBV基因组的存在，且在血管内皮细胞（HUVECs）中启动活性最佳；③IFN-γ可以诱导Rta启动子活性；但HIV-1Tat和gp120蛋白与IFN-γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱。结论 HIV-1感染中相关细胞因子IFN-γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV-8的复制。